流感病毒快速檢測方法在兒童流感樣病例病原診斷中的應(yīng)用

王 芳 孫 宇 朱汝南 趙林清 鄧 潔 廖 斌 黃榮妍 錢 淵

流感病毒是僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的可引起嬰幼兒急性呼吸道感染的常見重要病毒病原之一。流感病毒分甲(A)、乙(B)和丙(C)3 個(gè)型別。目前，感染人類的甲型流感病毒根據(jù)抗原性和基因特征分為甲1(H1N1)和甲3(H3N2)型，乙型流感病毒分為Victoria 和Yamagata 兩大譜系。甲型流感病毒抗原變異活躍，可引起世界范圍的大流行。而乙型流感病毒感染和傳播的嚴(yán)重程度不如甲型流感病毒，但也常引起小規(guī)模的暴發(fā)流行［1，2］。在流感的流行季節(jié)，往往因急性呼吸道感染而發(fā)熱的就診患兒驟增，臨床上需要快速、準(zhǔn)確、操作簡便和適用于臨床應(yīng)用的流感病毒病原診斷方法，以便對出現(xiàn)流感樣癥狀的患兒及早做出正確的病原診斷，采取恰當(dāng)?shù)闹委煼桨浮Ｄ壳坝幸恍┛捎糜谂R床實(shí)驗(yàn)室快速診斷呼吸道病毒的方法［3］，如檢測抗原的有ELISA、免疫熒光法;檢測病毒核酸的有PCR、RTPCR 等，上述方法經(jīng)過了與經(jīng)典病毒學(xué)方法(如病毒分離法)的大量比較，證明其敏感、特異和可靠，但需要特殊的儀器設(shè)備和經(jīng)特殊培訓(xùn)的技術(shù)人員，而且檢測所需要的時(shí)間較長，因此不宜在臨床、尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用推廣。目前一些更加簡便快速的診斷方法被陸續(xù)推出［4］。用膠體金、膠乳免疫層析法來進(jìn)行抗原檢測的方法逐漸應(yīng)用于呼吸道病毒的檢測，這些方法檢測時(shí)間短，標(biāo)本采集后8 ～15 min 便可用肉眼觀察結(jié)果，不需要特殊設(shè)備，有望在臨床實(shí)驗(yàn)室甚至在基層的社區(qū)醫(yī)院推廣。本研究報(bào)道了一種已在國外臨床使用的流感病毒抗原快速檢測方法在兒科流感樣病例病原診斷中的應(yīng)用結(jié)果，并將該方法與流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)——病毒分離法進(jìn)行比較分析。

1 方法

1.1 標(biāo)本來源 2010 年12 月至2011 年4 月根據(jù)中國衛(wèi)生部頒布的《流行性感冒診斷與治療指南(2011 年版)》從首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院門診采集發(fā)病3 d 內(nèi)的流感樣病例(即體溫≥38℃，伴咳嗽、咽痛或流涕癥狀之一，同時(shí)缺乏其他實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù))的14 歲以下患兒的咽拭子標(biāo)本。流感樣病例的納入和標(biāo)本采集由經(jīng)培訓(xùn)的臨床醫(yī)生負(fù)責(zé)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法 ①流感病毒抗原檢測采用甲型和乙型流感病毒抗原檢測試劑盒，以推薦的流感病毒檢測的病毒分離法［《流行性感冒診斷與治療指南(2011 年版)》］為對照方法，并檢測該試劑盒與其他常見的呼吸道病毒之間的交叉反應(yīng)性。每次采集的標(biāo)本在現(xiàn)場進(jìn)行抗原快速診斷(8 min 出結(jié)果);②病毒分離法則是將標(biāo)本收集后于當(dāng)日進(jìn)行細(xì)胞接種(幾天至2 周出結(jié)果)。③對于抗原檢測和病毒分離法結(jié)果不相符的咽拭子標(biāo)本集中采用RT-PCR方法驗(yàn)證。三部分實(shí)驗(yàn)由不同的實(shí)驗(yàn)人員操作。

1.3 標(biāo)本采集方法 同時(shí)用兩支無菌粘膠纖維采樣拭子(Copan 公司，意大利)對有流感樣癥狀的就診患兒采集咽拭子標(biāo)本，其中一支拭子放入病毒采樣液中立刻置于冰壺，用于病毒分離(需要時(shí)行RT-PCR 驗(yàn)證)，另一支拭子即刻在現(xiàn)場進(jìn)行流感病毒抗原的快速診斷。

1.4 流感病毒抗原檢測 使用甲型和乙型流感病毒抗原檢測試劑盒(QuickNaviTM-Flu，生研公司產(chǎn)品，日本)膠乳免疫層析法對咽拭子標(biāo)本進(jìn)行抗原檢測。使用該試劑盒時(shí)將樣品滴加在檢測卡的樣品孔中，樣品通過毛細(xì)管現(xiàn)象移動至結(jié)合墊，溶解此處的抗甲型及抗乙型抗體結(jié)合乳膠，與樣品中的甲型或乙型抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物。該免疫復(fù)合物通過毛細(xì)管現(xiàn)象移動至試紙的薄膜內(nèi)，被固定在測試帶上的抗甲型或抗乙型抗體特異性捕捉，甲型呈紅色帶狀、乙型呈藍(lán)色帶狀。該試劑盒可以使用一個(gè)檢測卡同時(shí)檢測標(biāo)本中的甲型或乙型流感病毒抗原。標(biāo)本采集和加樣嚴(yán)格按照說明書操作，于加樣后8 min 肉眼判定檢測結(jié)果。

1.5 病毒分離法 咽拭子標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后，接種于傳代狗腎細(xì)胞(MDCK)，置33℃恒溫室培養(yǎng)。用于病毒分離的維持液含有2 μg·mL－1的TPCK 處理的胰酶(Sigma 公司，美國)。逐日觀察細(xì)胞病變，自標(biāo)本接種后第3 日起每隔2 d 用0.75%的豚鼠血細(xì)胞進(jìn)行血細(xì)胞凝集試驗(yàn)(簡稱血凝試驗(yàn))。血凝試驗(yàn)陽性的培養(yǎng)液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)鑒定型別。第1 代病毒分離的細(xì)胞上清血凝試驗(yàn)陰性者行盲傳培養(yǎng)。傳第2 代培養(yǎng)仍為陰性者判定為病毒分離陰性。

1.6 流感病毒分離株型別鑒定 血凝試驗(yàn)陽性的培養(yǎng)上清中血凝滴度以(+ +)凝集的病毒，最高稀釋度的倒數(shù)為1 個(gè)血凝單位。制備4 個(gè)血凝單位作為抗原，用血凝抑制試驗(yàn)鑒定流感病毒亞型［甲1(原季節(jié)性H1N1)、H3N2、乙型(Victoria 和Yamagata 系)、2009 甲型H1N1］。用于分離株型別鑒定的流感病毒特異性分型血清為WHO 的流感病毒參考血清，均由美國CDC 流感實(shí)驗(yàn)室提供。

1.7 標(biāo)本核酸提取 咽拭子標(biāo)本液(與病毒分離所用同一管)按常規(guī)處理并使用QIAamp?Viral RNA Mini Kit(Qiagen 公司)提取標(biāo)本中的核酸。按照說明書進(jìn)行操作。

1.8 RT-PCR 以中國國家流感中心提供的特異性引物和探針，參照中國流感中心下發(fā)的RT-PCR 方法，對抗原檢測與病毒分離法結(jié)果不相符的標(biāo)本進(jìn)行流感病毒核酸檢測和型別鑒定［2］。

1.9 QuickNaviTM-Flu 與其他常見呼吸道病毒之間的交叉反應(yīng)性 使用QuickNaviTM-Flu 檢測常見的其他6 種呼吸道病毒的培養(yǎng)物，包括RSV、腺病毒、副流感病毒1 ～3 型和人偏肺病毒的培養(yǎng)物(本實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對QuickNaviTM-Flu 和病毒分離法的結(jié)果進(jìn)行Kappa 一致性檢驗(yàn)分析。Kappa 值≥0.75，表明兩者一致性較好;0.75 ＞Kappa 值≥0.4，表明兩者一致性一般;Kappa 值＜0.4，表明兩者一致性較差。

2 結(jié)果

本研究納入流感樣病例共350 例，其中男204 例，女146 例。患兒年齡為1 個(gè)月至13 歲。所采集的咽拭子標(biāo)本同時(shí)進(jìn)入病毒抗原快速診斷和病毒分離法分析。

2.1 病毒分離結(jié)果 從350 例咽拭子標(biāo)本中分離到106株流感病毒，陽性率為30.3%。經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)鑒定，其中8 株為乙型流感病毒(3 株Victoria 和5 株Yamagta 系毒株);98 株為甲型流感病毒(包括72 株H3N2，26 株2009 甲型H1N1)。流感病毒陽性患兒中～6 歲組為46.2%，～3歲組為30.2%(表1)。

表1 不同型別流感病毒陽性患兒的年齡分布［n(%)］Tab 1Age distribution of children infected by different type influenza viruses［n(%)］

2.2 標(biāo)本中流感病毒抗原檢測結(jié)果 350 例咽拭子標(biāo)本經(jīng)QuickNaviTM-Flu 試劑盒檢測，顯示102 例標(biāo)本為甲型流感病毒陽性，陽性率為29.1%;7 例標(biāo)本為乙型流感病毒陽性，陽性率為2.0%;總陽性率為31.1% (109/350)。

2.3 流感病毒抗原檢測與病毒分離法結(jié)果比較

2.3.1 甲型流感病毒檢測結(jié)果比較 表2 顯示，88 例咽拭子標(biāo)本采用QuickNaviTM-Flu 檢測甲型流感病毒抗原與病毒分離法均為陽性，10 例為抗原檢測陰性而病毒分離法陽性，敏感度為89.8%(88/98);238 例用QuickNaviTM-Flu檢測甲型流感病毒抗原與病毒分離法均為陰性，14 例為抗原檢測陽性而病毒分離法陰性，特異度為94. 4% (238/252)，總符合率為93.1%［(88 +238)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa=0.832，95%CI:0.767 ～0.897)。

表2 流感病毒抗原檢測和病毒分離法檢測甲型流感病毒比較(n)Tab 2Comparison of influenza virus A detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.2 乙型流感病毒檢測結(jié)果比較 表3 顯示，7 例咽拭子標(biāo)本用QuickNaviTM-Flu 檢測乙型流感病毒抗原與病毒分離法均為陽性，1 例為抗原檢測陰性而病毒分離法陽性，敏感度為87.5%(7/8);342 例用QuickNaviTM-Flu 檢測乙型流感病毒抗原和病毒分離法均為陰性，特異度為100%(342/342)，總符合率為99.7%［(7 +342)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa =0. 932，95% CI:0.799 ～1.066)。

表3 流感病毒抗原檢測和病毒分離法檢測乙型流感病毒比較(n)Tab 3Comparison of influenza virus B detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.3 甲型和乙型流感病毒總檢測結(jié)果比較 表4 顯示，QuickNaviTM-Flu 檢測甲型和乙型流感病毒抗原與病毒分離法的總敏感度為89.6%［(88 +7)/(98 +8)］，總特異度為94.3% (230/244)，總符合率為92.9%［(88 +7 +230)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa =0.832，95%CI:0.769 ～0.895)。

表4 流感病毒抗原檢測和病毒分離法檢測甲型和乙型流感病毒的比較(n)Tab 4Comparison of influenza virus A and B detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.4 RT-PCR 驗(yàn)證后結(jié)果比較 表5 顯示，QuickNaviTMFlu 檢測甲型流感病毒抗原陽性而病毒分離法為陰性的14例標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后13 例為陽性，與QuickNaviTMFlu 結(jié)果一致，1 例仍為陰性;10 例病毒分離法陽性而QuickNaviTM-Flu 檢測陰性標(biāo)本經(jīng)PCR 驗(yàn)證后均為陽性。以RT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果作為最終標(biāo)準(zhǔn)修正后，顯示敏感度、特異度和總符合率均有所升高(分別為91. 0%、99. 6% 和96.9%)，兩種方法的一致性也相應(yīng)升高(Kappa =0.926，95%CI:0.883 ～0.969)。

1 例病毒分離法為乙型流感病毒陽性而QuickNaviTMFlu 檢測為陰性的標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR 方法驗(yàn)證后為陽性，因此QuickNaviTM-Flu 檢測乙型流感病毒的結(jié)果與未驗(yàn)證之前一致。

表5 經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后QuickNaviTM-Flu 和病毒分離法檢測甲型流感病毒的比較(n)Tab 5Comparison of influenza virus A detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation verified by realtime RT-PCR(n)

2.4 與其他呼吸道病毒的交叉反應(yīng) 以其他常見的6 種呼吸道病毒的培養(yǎng)物作為待檢樣本，使用QuickNaviTM-Flu檢測，結(jié)果均為陰性。

3 討論

流感是全球傳染性較強(qiáng)的感染性疾病之一。由于流感病毒易發(fā)生抗原漂移，人群對流感病毒普遍易感。在歷史上，全球出現(xiàn)過數(shù)次流感大流行，最近一次發(fā)生的大流行于2009 年3 月首先在墨西哥暴發(fā)了甲型H1N1 流感，隨后迅速蔓延至世界各地，對公眾健康和社會造成了嚴(yán)重的危害，中國同樣也受到了波及［5］。研究顯示，0 ～3 歲嬰幼兒感染流感之后因嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致住院的可能性與65 歲以上老年人相當(dāng)，屬于高危人群。同時(shí)學(xué)齡前和學(xué)齡期兒童往往是流感的第一受害者，并成為主要的傳播者之一［6］。因此流感樣病例的快速病原診斷非常重要，及時(shí)確診有利于正確的治療。

至今仍認(rèn)為流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為病毒分離法，但需要進(jìn)行細(xì)胞或雞胚分離培養(yǎng)，一般耗時(shí)3 ～7 d。流感病毒的快速診斷包括了抗原檢測和核酸檢測。核酸檢測需要對臨床標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行提取、逆轉(zhuǎn)錄和目的基因的擴(kuò)增及檢測，一般耗時(shí)4 h 左右，并且需要在符合條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。抗原檢測可采用免疫熒光法和免疫層析法檢測，耗時(shí)短。免疫熒光法需要特殊儀器及有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員進(jìn)行結(jié)果判斷，而免疫層析法可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)特異性的抗原檢測，確定病原。本研究比較分析了利用免疫層析法對流感病毒進(jìn)行快速抗原檢測的方法在兒科流感樣病例病原診斷中的應(yīng)用效果。

QuickNaviTM-Flu 試劑盒只需單獨(dú)一個(gè)檢測卡即可在8 min 內(nèi)對甲型和乙型流感病毒進(jìn)行抗原診斷并分型，并且與其他常見的呼吸道病毒之間無交叉反應(yīng)。本研究顯示該方法與經(jīng)典的流感病毒培養(yǎng)的一致性好，其檢測甲型流感病毒的敏感度為89.9%，特異度為94.4%。經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后，13/14 例抗原檢測和病毒分離法不相符樣本結(jié)果為陽性(與抗原檢測結(jié)果一致)，使該抗原檢測方法的敏感度和特異度升至91.0%和99.6%?？乖瓩z測乙型流感病毒經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證前后的結(jié)果一致，因此檢測乙型流感病毒抗原的敏感度和特異度仍為87.5%和100%。病毒分離法結(jié)果顯示在陽性標(biāo)本中包括了H3N3、乙型(Victoria 和Yamagata 系)和新發(fā)的2009 甲型H1N1，提示該試劑盒所提供的抗原檢測方法雖然不能對標(biāo)本中的流感病毒進(jìn)行亞型的鑒別，但是能夠很好地檢出目前在人類流行的所有流感病毒亞型，包括2009 年新出現(xiàn)的豬源的發(fā)生人類大流行的甲型H1N1。

QuickNaviTM-Flu 作為流感病毒抗原診斷的試劑盒，耗時(shí)短，操作簡便，具有良好的敏感度和特異度，在臨床病例的診斷、流感監(jiān)測和突發(fā)疫情時(shí)可在短時(shí)間內(nèi)對流感疑似病例進(jìn)行病原的排查和確診。

［1］Wang F(王芳)，Zhu RN，Qian Y，et al. Surveillance for influenza B virus infections in infants and young children in Beijing，China. Chin J Pediatr(中華兒科雜志)，2008，46(2):94-97

［2］Zhu RN(朱汝南)，Qian Y，Wang F，et al. Surveillance for influenza A virus infections in infants and young children in Beijing，China，2001-2005. Chin J Pediatr(中華兒科雜志)，2006，47(11):518-522

［3］Yang JR，Lo J，Liu JL，et al. Rapid SYBR Green I and modified probe real-time RT-PCR assays identify influenza H1N1 viruses and distinguish between pandemic and seasonal strains. J Clin Microbiol，2009，47(11):3714-3716

［4］Hurt AC，Alexander R，Hibbert J，et al. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. J ClinVirol，2007，39(2):132-135

［5］Cao B，Li XW，Mao Y，et al. Clinical features of the initial cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus infection in China. N Engl J Med，2009，361(26):2507-2517

［6］Writing Committee of the WHO Consultation on Clinical Aspects of Pandemic (H1N1)2009 Influenza. Bautista E，Chotpitayasunondh T，Gao Z，et al. Clinical aspects of pandemic 2009 influenza A (H1N1)virus infection. N Engl J Med，2010，362(18):1708-1719