羅勒籽脂肪酸及其對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制作用的研究

胡爾西丹·伊麻木，馬慶苓，阿布力米提·伊力，熱娜·卡斯木，阿吉艾克拜爾·艾薩中國科學院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊800;中國科學院研究生院，北京0009; 新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊80054

羅勒(Ocimum basilicum L.)，為唇形科羅勒屬中的一種，俗名九層塔，丁香，蘭香等，為一年生草本植物，極具芳香。在我國連栽培在內(nèi)有5種，3變種［1，2］。羅勒籽為唇形科(Lamiaceae)植物羅勒的干燥成熟果實，又名蘭香子或明列子(Basil seed)，在國際上具有植物黃金的美稱。坊間商業(yè)性俗名稱花粉子、小紫蘇、珍珠果、明珠果等。在維吾爾醫(yī)藥中羅勒籽藥性為干寒，味辛。功能為生干生寒，燥濕止瀉，涼血止血，清熱爽心。主治濕熱性或血熱質(zhì)性疾病，如濕熱性痢疾、腹痛、腹瀉、便血、痔瘡出血及熱性心臟疾?。?］?，F(xiàn)代研究表明羅勒籽具有提高代謝、促進大腦發(fā)育、抗血栓、降血脂、減少中風和高血壓發(fā)病幾率的作用［4，5］。

近年來，關(guān)于羅勒和羅勒籽的脂肪酸成分，以及羅勒籽揮發(fā)油和芳香性成分國內(nèi)有過報道［1，6-8］，而對新疆產(chǎn)羅勒籽的脂肪酸化學成分及其生物活性的研究卻未見深入報道。新疆具有特殊的地理和氣候條件，正是這種獨特的地理環(huán)境，孕育出奇特的維吾爾藥材。新疆植物中的化學成分以及活性成分含量與其他地方存在著差異。為了進一步開發(fā)利用新疆羅勒籽的食用和藥用價值［9-11］，本論文利用索氏提取法提取羅勒籽油，向羅勒籽油加入氫氧化鉀甲醇溶液后并用水浴加熱，加入正己烷和蒸餾水萃取，用氣相色譜質(zhì)譜法(GC/MS)對萃取得到的脂肪酸進行分析;同時對其進行PTP1B的抑制作用的研究，以期為羅勒籽的深入研究提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器

1.1.1 材料

羅勒籽:購于新疆和田，由經(jīng)中科院生態(tài)與地理研究所沈冠冕研究員鑒定為菊科羅勒屬植物羅勒Ocimum basilicum L.干燥成熟果實，標本存放于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所標本室;其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司);BP211D型電子天平(德國Sartorius有限公司);RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);HH-W600三用恒溫水箱(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);SpectraMax M5型酶標儀;平底96孔ELISA板。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

稱取200 g羅勒籽，加入石油醚(60～90℃)，索氏提取法提取8 h，提取液用無水硫酸鈉脫水，減壓回收溶劑，得28.1 g淡黃色油狀液體，其出油率為14.05%。

稱取油樣50 mg，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，加2 mL 0.5 mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液，于60℃水浴加熱60 min，加入2 mL正己烷，再加蒸餾水至刻度，取出上清液，用正己烷洗1次，合并上清液于小瓶中待測。

1.2.2 GC-MS分析

色譜條件:RTX-5MS石英毛細管色譜柱(30 m ×0.32 mm ×1.0 μm);升溫程序:160℃保持2 min，以5℃/min升至260℃，保持10 min;進樣口溫度:260℃;載氣(99.999%He)流速1.0 mL/ min，壓力96.1 kPa;進樣量1 μL;分流比20∶1。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度200℃;傳輸線溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

取上清液1 μL進行測定，按峰面積歸一化法計算化學成分的質(zhì)量分數(shù)。所得質(zhì)譜圖采用Nist147譜庫及Wiley7譜庫進行檢索。

1.2.3 PTP1B抑制作用的研究

按照文獻［12］方法，即樣品用適量DMSO溶解，取1 μL加入至200 μL反應(yīng)體系中(pH 6.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaC1，5 mmol/L DDT，50 mmol/L檸檬酸)，加入底物pNPP至10 mmol/L，加入人重組PTP1B(PROSPEC)0.5 μg開始反應(yīng)，37℃保溫30 min，加入10 mmol/L。NaOH 20 μL終止反應(yīng)，用酶標儀在405 nm測定吸收度(A)值，以原釩酸鈉作為陽性對照，以不加PTP1B為空白對照，計算抑制率;

抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%

應(yīng)用Origin軟件計算IC50值，以此判斷羅勒籽脂肪酸對PTP1B的抑制能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅勒籽油脂肪酸成分分析

按照上述條件，測得羅勒籽脂肪酸甲酯的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)，見圖1，脂肪酸甲酯成分有4種，見表1。

圖1 羅勒籽脂肪酸甲酯GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS of the fatty acids methyl ester from the seed of O.basilicum

表1 羅勒籽脂肪酸甲酯成分和含量Table 1 The main components of the fatty acids methyl ester from the seed of O.basilicum

15.746 C19H34O2 亞油酸甲酯Methyl linoleate 20.66 3 15.901 C19H32O2 α-亞麻酸甲酯Methyl α-linolenic acid 62.88 4 16.264 C19H38O2 硬脂酸甲酯2 Methyl stearate 5.79

由表1可知，在新疆產(chǎn)的羅勒籽的脂肪酸中，其含量最高的α-亞麻酸(62.88%)，其次為亞油酸(20.66%)。由于羅勒籽的產(chǎn)地、萃取方法、甚至儲藏等條件不同，所提取的羅勒籽脂肪酸的主要成分的含量有所不同，曹維金等［13］測定的羅勒籽油中的亞麻酸(53.88%)、亞油酸(22.16%)、油酸(13.798%)。

2.2 PTP1B抑制作用的研究

將得到的羅勒籽脂肪酸進行PTP1B抑制作用的研究。結(jié)果表明，陽性對照原礬酸鈉的IC50值為1.81 μg/mL，羅勒籽脂肪酸對PTP1B有較強的抑制作用，其IC50值為11.12 μg/mL。

由表1可知，羅勒籽脂肪酸中主要成分有α-亞麻酸 62.88%、亞油酸為 20.66%、棕櫚酸為10.67%、硬脂酸為5.79%，其中亞油酸和亞麻酸不飽和脂肪酸的含量很高，可達80%以上，具有較高的營養(yǎng)價值。α-亞麻酸和亞油酸是人體必需脂肪酸，且無法由人體自行合成，必須從食物中攝取獲得［14］。具有抗血栓［10］、降血脂［15］、降膽固醇［5］;促進大腦發(fā)育［16］，抑制缺血性心血管疾病等方面起重要作用［6］。

多年的臨床和動物實驗證明［17］，n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)的攝人能降低心血管疾病死亡率，降低血甘油三酯水平，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，減少血小板聚集，改善血管內(nèi)皮功能，降低血壓，改善胰島素抵抗等。n-3多不飽和脂肪酸主要包括 α-亞麻酸(AIJA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。在羅勒籽脂肪酸中含有62.88%的α-亞麻酸，由此可見，羅勒籽油是很好的保健食品，具有很高的食用和藥用價值。

3 結(jié)論

在羅勒籽脂肪酸中，共鑒定出4種脂肪酸，其中α-亞麻酸 62.88%、亞油酸 20.66%、棕櫚酸10.67%、硬脂酸5.79%。而且脂肪酸對PTP1B有較強的抑制作用，其IC50為11.12 μg/mL。

羅勒籽油中亞麻酸、亞油酸含量較多，具有良好的開發(fā)利用價值和廣闊的應(yīng)用前景。本文為我國新疆羅勒籽在食品及藥用產(chǎn)品領(lǐng)域的開發(fā)提供了一定理論依據(jù)，并為羅勒籽的深入研究和資源利用奠定了基礎(chǔ)。

1 Hurshida GJ(胡西旦·格拉吉丁).Analysis of chemical components of the essential oil from Ocimum basilicum.L by Gas Chromatography-Mass Spectrometry.J Chin Spectrosc Lab(光譜實驗室)，2008，25:127-131.

2 Ye JC，Hsiao MW，Hsieh CH，et al.Analysis of caffeic acid extraction from Ocimum gratissimum Linn.by high performance liquid chromatography and its effects on a cervical cancer cell line.Taiwan J Obstet Gynecol，2010，49:266-271.

3 Editorial committee of Chinese Materia Medica of state administration of traditional chinese medicine，Chinese Materia Medica-Uigur Pharmacopoeia Fascicule(中華本草-維吾爾藥卷)，2005，Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，237-239.

4 Amrani S，Harnafi H，Gadi D，et al.Vasorelaxant and antiplatelet aggregation effects of aqueous Ocimum basilicum extract.J Ethnopharmacol，2009，125:157-162.

5 Harnafi H，Aziz M，Amrani S.Sweet basil(Ocimum basilicum L.)improves lipid metabolism in hypercholesterolemic rats.E Spen Eur E J Clin Nutr Metab，2009，4:181-186.

6 Carovic-Stanko K，Orlic S，Politeo O，et al.Composition and antibacterial activities of essential oils of seven Ocimum taxa.Food Chem，2010，119:196-201.

7 Dambolena JS，Zunino MP，Lez AG，et al.Essential oils composition of Ocimum basilicum L.and Ocimum gratissimum L.from Kenya and their inhibitory effects on growth and fumonisin production by Fusarium verticillioides.Innov Food Sci Emerg Technol，2010，11:410-414.

8 Li JW(李建文)，Chen GL(陳貴林).Analysis of volatile components of Ocimum basilicum L.by GC/MS.Mod Instrum (現(xiàn)代儀器)，2003，(2):17-20.

9 Kta SoM，Vincent C，Schmit JP，et al.Efficacy of essential oil of Ocimum basilicum L.and O.gratissimum L.applied as an insecticidal fumigant and powder to control Callosobruchus maculatus(Fab.).J Stored Prod Res，2001，37:339-349.

10 Tognolini M，Barocelli E，Ballabeni V，et al.Comparative screening of natural essential oils:phenylpropanoid moiety as basic core for antiplatelet activity.Life Sci，2006，78:1419-1432.

11 Marinova EM，Yanishlieva NV.Antioxidative activity of extracts from selected species of the family Lamiaceae in sunflower oil.Food Chem，1997，58:245-248.

12 Hu XX(胡辛欣)，Yang YF(楊雁芳)，Zhang YT(張英濤).Preliminary exploration of inhibitory activities of Salvia species on PTPIB.Acta Pharm Sin(藥學學報)，2009，44: 440-442.

13 Cao WJ(曹維金)，Chen N(陳娜).Optimal extraction technology of fats and oil from the seeds of Ocimum basilicum L.and GC-MS analysis of the fatty Acid.Farm Machinery(農(nóng)業(yè)機械)，2011，12:48-51.

14 Bi YL(畢艷蘭)，Guo Z(郭諍)，Yang TK(楊天奎).Fats and Oils Chemistry(油脂化學).Beijing:Chemical Industry Press，2005.9-10.

15 Tohti I，Tursun M，Umar A，et al.Aqueous extracts of Ocimum basilicum L.(sweet basil)decrease platelet aggregation induced by ADP and thrombin in vitro and rats arterio-venous shunt thrombosis in vivo.Thromb Res.2006，118:733-739.

16 Beric T，Nikolic B，Stanojevic J，et al.Protective effect of basil(Ocimum basilicum L.)against oxidative DNA damage and mutagenesis.J Food Chem Toxicol，2008，46:724-732.

17 Mao TJ(毛童俊)，Chen WP(陳偉平).Progress in the study on the molecular mechanisms of diabetic treatment with n-3 polyunsaturated fatty acid.Foreign Med Sci，Section Hygiene (國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊)，2008，35:352-355.