杜仲綠原酸對高脂小鼠血液流變學作用研究

王建輝，劉永樂，李赤翎，俞 健，王發(fā)祥，李向紅，李 艷

1長沙理工大學食品與生物工程系，長沙410114;2長沙高新開發(fā)區(qū)大自然生物科技有限公司，長沙410205

高血脂和動脈硬化及冠心病的發(fā)生發(fā)展有著密 切的關(guān)系，是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的生化、病理基礎(chǔ)，可引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的改變，使高血脂動物血漿脂質(zhì)過氧化物含量增加，抗氧化酶活力降低，易導致動脈血管內(nèi)膜的損傷，脂類物質(zhì)附著于動脈血管壁，引起血液流變學病理變化，造成動脈粥樣硬化斑化，動脈血管變窄，甚至完全阻塞，造成供血部位缺血性損害［1］。

杜仲作為我國傳統(tǒng)中草藥，我研究團隊已開展杜仲提取物和杜仲綠原酸研究多年，前期研究發(fā)現(xiàn):杜仲提取物尤其是杜仲綠原酸的體內(nèi)外抗氧化作用，調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)代謝及機體免疫等性能優(yōu)良［2-4］，且具有潛在的降血脂作用。綠原酸等多酚類物質(zhì)被譽為“第七類營養(yǎng)素”。自1947年首次確定其化學結(jié)構(gòu)以來，大量研究表明綠原酸具有一系列生理活性，其自由基清除活性為IC50=3.09 μg/mL［5］;能抑制LDL的氧化，上調(diào)細胞抗氧化酶的表達，抗氧化能力優(yōu)于BHA和生育酚，與BHT相當，其腸道水解產(chǎn)物咖啡酸的抗氧化性能更為優(yōu)良［6］;能有效增加大鼠血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如TBA反應(yīng)底物和脂質(zhì)過氧化體含量［7］，提高小鼠肝臟GSH/GSSG和Cys/ CySS比率，穩(wěn)定腸道GSH/GSSG和Cys/CySS比率，維持其肝臟巰基氧化還原平衡［8］。國外研究發(fā)現(xiàn)口服綠原酸有降低大鼠內(nèi)臟脂肪堆積和體質(zhì)量的趨勢［9］;綠原酸靜脈給藥能顯著降低大鼠血漿中膽固醇和甘油三脂的含量，及肝臟中的甘油三脂水平［10］。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)杜仲的乙醇提取物(含綠原酸約4%)具有降血脂功能［11］，然尚無杜仲高純度綠原酸降血脂作用研究報道，更無綠原酸對高血脂小鼠血液流變學影響的系統(tǒng)研究，本文擬采用高脂和高膽固醇膳食誘導構(gòu)建小鼠高脂血癥模型，通過綜合分析杜仲綠原酸對血液流變學變化及體內(nèi)抗氧化酶活性、過氧化狀態(tài)的影響，旨以揭示綠原酸改善高血脂動物血液流變學參數(shù)的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

杜仲綠原酸(實驗室自制，98%);硫代巴比妥酸(上?；瘜W試劑三廠);二甲亞砜AR(津市化學試劑三廠);10 nmol/L四乙氧基丙烷;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAC)、考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，分析所用的其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

722S型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品);恒溫水浴鍋(北京國華儀器有限公司產(chǎn)品);臺式離心機(湖南賽特湘儀離心機公司);微量式移液器(德國Eppendorf);全自動生化儀(深圳邁瑞醫(yī)用儀器有限公司);MV IS22035全自動血液流變分析系統(tǒng)(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.3 動物及高脂模型建立

1.3.1 試驗動物

選取體重18～22 g昆明小鼠70只，♀♂各半。

1.3.2 日糧配方

普通飼料配方:玉米面58.5%;麩皮35%;面粉3%;魚粉2%;食鹽1%;魚肝油0.5%［12，13］;高脂飼料配方:膽固醇3.00%、丙基硫氧嘧啶0.20%、豬油10.00%、普通飼料86.80%［14］。

1.3.3 高脂模型的建立

飼以基礎(chǔ)飼料1周后，將小鼠以體重為區(qū)組因素隨機分成5組，每組10只，除空白對照組給予一般日糧外，其他4組均給予高脂飼料。各組小鼠自由采食，自由飲水。4周后在形態(tài)學上和血清檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組小鼠相比，高脂血癥模型組血清總膽固醇含量明顯升高，肝臟顏色呈淡黃色，說明按該方法建模成功。

1.3.4 試驗管理

造模成功小鼠，按試驗初始時分組情況分為空白對照組、高脂模型組和杜仲綠原酸組高、中、低劑量組，分別飼喂杜仲綠原酸100，50，25 mg/kg BW，除空白對照組給予普通飼料外，其他4組均給予高脂飼料。同時綠原酸各組以100，50，25 mg/kg BW劑量灌胃，空白和高脂對照組灌服等容量的生理鹽水，每天兩次，上午8-9點，下午3-4點各一次，連續(xù)喂飼4周，每周末禁食12 h稱重，試驗結(jié)束時，眼眶取血，制備血清，備用;并摘取完整肝臟，用0～4℃冷生理鹽水洗去血污，濾紙吸干后稱重。取適量肝臟，用冷生理鹽水和異丙醇制成10%勻漿，4000 rpm離心15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察方法與測定指標

血清(肝臟)常規(guī)生化指標測定用深圳邁瑞全自動生化分析儀或722S型紫外可見分光光度計完成;血液流變學指標測定采用MV IS22035全自動血液流變分析系統(tǒng)。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值表示，顯著性統(tǒng)計采用SAS8.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析，并進行Duncan氏多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGA小鼠血液流變學指標的影響

杜仲綠原酸對小鼠血液流變學指標的影響見表1。經(jīng)高脂誘導后，高脂模型組小鼠全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積和纖維蛋白原水平均顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。飼喂杜仲綠原酸后，各劑量組模型小鼠全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積和纖維蛋白原水平均顯著低于高脂模型組(P＜0.05)，其中，中劑量組(50 mg/kg BW)模型小鼠血漿粘度和纖維蛋白水平與陰性對照組無顯著差異(P＞ 0.05)。同時，經(jīng)高脂誘導后，高脂模型組小鼠紅細胞變形系數(shù)顯著降低、剛性和聚集指數(shù)顯著增加、血沉顯著增加(P＜0.05)。飼喂杜仲綠原酸后，各劑量組模型小鼠紅細胞變形指數(shù)顯著提高(P＜0.05)，中、低劑量組與陰性對照組無顯著差異 (P＞0.05);各劑量組模型小鼠紅細胞剛性指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，其中，中劑量組接近陰性對照組水平(P＞0.05);中劑量組聚集指數(shù)和血沉均顯著低于其余各劑量組(P＜0.05)，但仍顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。

表1 綠原酸對高脂小鼠血液流變學的影響Table 1 Effects of CGA on hemorheological changes of hyperlipidemia mice

2.2 CGA對小鼠血清和肝臟TAC、羥自由基清除能力影響

圖1 綠原酸對高脂小鼠血清和肝臟勻漿總抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of CGA on Total Antioxidant Capabilities levels in serum and liver of hyperlipidemia mice

圖2 綠原酸對高脂小鼠血清和肝臟勻漿超氧陰離子清除率的影響Fig.2 Effects of CGA on Hydroxyl Radical Scavenging rates in serum and liver of hyperlipidemia mice

杜仲綠原酸對小鼠血清和肝勻漿TAC和羥自由基清除能力的影響結(jié)果如圖1～2，經(jīng)高脂飼料誘導后，高脂模型組小鼠血清和肝臟的TAC和羥自由基清除能力較陰性對照組均顯著降低(P＜0.05)，飼喂杜仲綠原酸后，3個劑量組血清中的TAC和羥自由基清除能力均較高脂模型組均顯著升高(P＜0.05)，且兩兩間差異均達顯著水平(P＜0.05)。3個劑量組肝臟中的TAC和羥自由基清除率均顯著高于高脂模型組(P＜0.05)，但與陰性對照組間均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 CGA對小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px、MDA含量影響

經(jīng)高脂高膽固醇誘導，高脂模型組小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px水平顯著低于陰性對照組(P＜0.05)。飼喂杜仲綠原酸，各劑量組血清和肝臟SOD活性均顯著升高(P＜0.05)，且顯著高于陰性對照組(P＜0.05)(圖3)。各劑量組血清和肝臟GSH-Px活性顯著高于模型組(P＜0.05)，但與陰性對照組間無顯著差異(P＞0.05)(圖4)。同時，各劑量組小鼠血清和肝臟MDA含量較模型組顯著下降(P＜0.05)(圖5)。

3 討論

高脂血癥包括血漿TC過高、TG過高、LDL-C過高和HDL-C過低，符合其中的任何一項或幾項，即為高脂血癥［15-17］，它是人體脂肪代謝異常的表現(xiàn)，是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的生化、病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化的重要因素。血膽固醇水平過高可導致動脈血管內(nèi)膜損傷，易使脂質(zhì)類物質(zhì)附著于動脈血管壁上，形成動脈粥樣硬化斑化，使動脈血管變窄，甚至完全阻塞，造成供血部位缺血性損害，增加冠心病發(fā)生危險。高脂血癥患者往往伴隨有血液流變學的異常。血液流變學是研究循環(huán)血液的流動性、變形性、凝固性、黏彈性以及心血管黏滯性的科學，是從細胞和分子水平上研究血液成分的流變特性，如紅細胞膜變形、聚集，纖維蛋白原的水平對流變特性的影響。紅細胞本身的流變學異常包括紅細胞剛性增大，變形能力下降［18］。

自由基的危害主要為脂質(zhì)過氧化作用，導致細胞代謝和功能障礙。對MDA的檢測可反映出機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機體細胞受自由基攻擊的損傷程度［19］，MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，它能與人體內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA聚合，使蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變異;同時，改變膜的流動性、結(jié)構(gòu)和功能，增加膜脆性。SOD是一種重要的抗氧化酶，其能清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、維持機體氧化與抗氧化平衡，保護細胞免受損傷［20］。GSH-PX是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，其能特異性地催化GSH成為氧化型谷胱甘肽GSSG，將有毒過氧化物自由基還原成無害的羥基化物，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［21］。

本研究表明，小鼠經(jīng)高脂高膽固醇飼料誘導后，高脂血癥小鼠的全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積、血沉、纖維蛋白原、紅細胞剛性指數(shù)和聚集指數(shù)顯著升高，紅細胞變形指數(shù)顯著降低，飼喂杜仲綠原酸后，高、中、低3個劑量組對高血脂小鼠的全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積、血沉、纖維蛋白原、紅細胞剛性指數(shù)和聚集指數(shù)均顯著降低，紅細胞變形指數(shù)顯著升高，顯著改善了因血脂升高和脂類代謝紊亂所引起的一系列血液流變學指標的改變，使血液處于低濃、低粘、低聚、低凝狀態(tài)，可有效防止高脂血癥的發(fā)展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，飼喂杜仲綠原酸后，高、中、低3個劑量組模型小鼠血清和肝臟SOD、GSH-Px水平、總抗氧化能力和羥自由基清除能力均顯著升高，MDA水平顯著降低，這表明在高脂誘導下，杜仲綠原酸能有效提高血清和肝臟清除自由基能力和抗氧化水平，降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，引起小鼠物質(zhì)代謝的顯著變化。這些物質(zhì)抑或通過提高脂肪酶活性，分解血液中LDL-C乳糜顆粒，從而起到預(yù)防和治療高脂血癥的作用;抑或促使機體合成更多的HDL進入血清，加速膽固醇在肝臟的分解，降低血脂水平;抑或是因為綠原酸可直接減少血清內(nèi)脂質(zhì)向紅細胞內(nèi)的侵入或促進紅細胞內(nèi)的膽固醇外移，或使GSH-Px活力升高，提高內(nèi)皮細胞防御氧化LPL損傷能力［22］，從而起到降血脂和抗動脈硬化的作用。

國內(nèi)外尚無綠原酸毒理研究的文獻報道，僅有些許報道指出綠原酸可能存在致敏性，且分歧較大［23-25］。而本研究發(fā)現(xiàn)杜仲綠原酸中劑量組效果最佳，高劑量組效果反而下降，究其原因，可能緣于綠原酸的結(jié)構(gòu)、存在形式間的差異，因綠原酸為次生代謝產(chǎn)物，其異構(gòu)體眾多，且在提取過程中可能存在一些同類物質(zhì)或其他雜質(zhì)如京尼平甙，當每日每公斤體重攝入量達50 mg則表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象［26］，加之，綠原酸本身不穩(wěn)定，在提取、純化、儲存過程中易發(fā)生變化，等等，均可能影響綠原酸效用的發(fā)揮?？傊?，杜仲綠原酸通過提高血液的抗氧化防御功能(包括抗氧化力、抗氧化酶活性)、調(diào)節(jié)血脂水平、改變血液流變學參數(shù)等，降低血液粘度、紅細胞剛性和聚集，增強變形能力，使細胞膜的流動性增高，最終發(fā)揮抗AS的作用，對高脂血癥、動脈粥樣硬化、腦血栓等心血管性疾病將具有較好的預(yù)防和治療作用，但是尚需進一步開展臨床研究與驗證。

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