煙酸修飾尾式卟啉的合成及其與人血清白蛋白的相互作用

彭玉苓 王樹軍 傅 麗 張成根 劉新剛

(廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,河北廊坊065000)

煙酸修飾尾式卟啉的合成及其與人血清白蛋白的相互作用

彭玉苓 王樹軍*傅 麗 張成根 劉新剛

(廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,河北廊坊065000)

合成了煙酸分子修飾的自由卟啉o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP、p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP及鋅配合物o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn、p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn.經(jīng)元素分析、紫外-可見光譜、核磁共振氫譜(1H NMR)、紅外(IR)光譜等對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,并通過量子化學(xué)方法計(jì)算了鋅卟啉的最低能量構(gòu)型.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn中側(cè)鏈煙酸基團(tuán)處于卟啉環(huán)上方,煙酸基團(tuán)中N原子與卟啉環(huán)中Zn2+存在著Zn―N間的分子內(nèi)配位作用,而p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn中側(cè)鏈煙酸基團(tuán)處于卟啉環(huán)較遠(yuǎn)的位置,一個(gè)鋅卟啉的中心Zn2+與另一個(gè)鋅卟啉煙酸中N原子之間存在著Zn―N間的分子間配位作用.同時(shí),為模擬金屬卟啉的生物功能,采用熒光光譜滴定法測(cè)定了金屬鋅卟啉與人血清白蛋白相互作用的光譜性質(zhì).熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金屬鋅卟啉與人血清白蛋白(HSA)之間發(fā)生了較強(qiáng)的靜態(tài)熒光猝滅作用,反應(yīng)機(jī)理是以氫鍵或van der Waals力結(jié)合反應(yīng).按照Stern-Volmer方程、Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程分析和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),得到了反應(yīng)的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)等.

煙酸;鋅卟啉;人血清白蛋白;熒光猝滅;熱力學(xué)參數(shù)

1 引言

血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì),含有多種可配位基團(tuán)能與生物體內(nèi)許多物質(zhì)作用.在生物體系中,金屬卟啉配合物是許多酶的活性中心,1-5在與血清白蛋白相互作用的研究中,卟啉分子可與血清白蛋白結(jié)合,其聚集狀態(tài)及在機(jī)體中的分布、代謝等生理過程都受到血清白蛋白的影響.因此,研究金屬卟啉與血清白蛋白相互作用的機(jī)理已引起了人們的極大興趣,當(dāng)前國內(nèi)外的文獻(xiàn)資料6-12中也較多地報(bào)道了金屬卟啉與牛血清白蛋白之間相互作用的研究成果.

煙酸(維生素B5)是具有生物活性的小分子,文獻(xiàn)13-15以煙酸充當(dāng)弱的電子供體通過1,3-二溴丙烷、1,6-二溴己烷和氨基將煙酸鍵連到卟啉環(huán),并重點(diǎn)研究了煙酸-卟啉二元化合物的電化學(xué)性質(zhì).

本文通過1,2-二溴乙烷將煙酸鍵連到卟啉環(huán)并在卟啉環(huán)周邊苯環(huán)上引入甲氧基作為供電子基團(tuán)合成了自由卟啉化合物o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP (H2P1)和p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP(H2P2)及對(duì)應(yīng)的鋅配合物o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn(ZnP1)和p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn(ZnP2),以期實(shí)現(xiàn)煙酸分子與卟啉化合物生物活性的疊加.同時(shí),為模擬金屬卟啉的生物功能活性,文中采用熒光光譜滴定法研究了鋅卟啉與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用,研究結(jié)果有利于我們深入認(rèn)識(shí)卟啉衍生物在生物體系中所發(fā)揮的重要功能.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 目標(biāo)化合物的合成

2.1.1 5-鄰(對(duì))羥基苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉的合成

參照文獻(xiàn)16的方法合成,取2.8 mL對(duì)甲氧基苯甲醛、0.78 mL水楊醛、100 mL丙酸溶于250 mL三頸燒瓶中,加入2.1 mL重蒸吡咯,機(jī)械攪拌,回流0.5 h,停止反應(yīng),冷卻到室溫.抽濾得藍(lán)紫色晶體,用蒸餾水洗滌2-3次,晾干.將粗產(chǎn)品用柱色譜進(jìn)行分離,固定相為氧化鋁,先用二氯甲烷為淋洗劑分離出第一色帶,再改用以一定比例的二氯甲烷:乙醇(V:V=40:1)配成的混合溶液為淋洗劑,收集主色帶,即為5-鄰羥基苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,產(chǎn)率為6.2%.

采用相同的方法合成了5-對(duì)羥基苯基-10,15, 20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,產(chǎn)率為7.8%.

2.1.2 5-鄰(對(duì))(2-溴乙氧基)苯基-10,15,20-

三(4-甲氧基苯基)卟啉的合成

參照文獻(xiàn)16的合成方法,在50 mL燒瓶中加入0.1 g 5-鄰羥基苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,15 mL二甲基甲酰胺(DMF),回流使之溶解,加入0.3 mL新蒸的1,2-二溴乙烷和0.3 g新焙燒過的無水碳酸鉀,在室溫下電磁攪拌36 h,用二氯甲烷進(jìn)行多次萃取至上層無色,再用蒸餾水多次洗滌,收集萃取液.柱色譜分離,固定相為氧化鋁,先用二氯甲烷為淋洗劑分離出第一色帶,再改用以一定比例的二氯甲烷:乙醇(V:V=40:1)配成的混合溶液為淋洗劑,收集主色帶,即為產(chǎn)品5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,產(chǎn)率為53.7%.

采用相同的方法合成了5-對(duì)(2-溴乙氧基)苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,產(chǎn)率為56.9%.

2.1.3 H2P1和H2P2的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入40 mg煙酸鈉(參考文獻(xiàn)16合成)和100 mg 5-鄰(2-溴乙氧基)苯基-10,15, 20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,并加入20 mL DMF,用75°C水浴加熱攪拌反應(yīng),待反應(yīng)完全停止后冷卻,加入60 mL飽和食鹽水使產(chǎn)物析出,過濾、洗滌、干燥.粗產(chǎn)品以硅膠為固定相,進(jìn)行柱色譜分離,先用二氯甲烷為淋洗劑分離第一色帶,再改用以一定比例的二氯甲烷:乙醚(V:V=25:1)配成的混合溶液為淋洗劑,收集主色帶,旋干得紫色晶體,產(chǎn)率為65.7%.

1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ:-2.852(s,2H,pyrrole N―H),1.540(s,9H,3OCH3),3.931-3.942(t,J=4.4 Hz,2H,―CH2),4.154-4.173(t,J=7.6 Hz,2H,―CH2), 6.277-6.303(m,J=10.4 Hz,1H,Py-2-H),7.296-7.317(d,J=8.4 Hz,1H,ArO-o-H),7.417-7.430(m,J= 5.2 Hz,6H+3H,3Ar-m-H+ArO-m,p-H),7.856-7.872 (t,J=6.4 Hz,1H,Py-4-H),8.030-8.063(t,J=13.2 Hz, 1H,Py-6-H),8.139-8.157(m,J=7.2 Hz,6H,3Ar-o-H),8.295-8.302(d,J=2.8 Hz,1H,Py-5-H), 8.816-8.845(m,J=11.6 Hz,8H,Pyrrole).C55H43N5O6· H2O元素分析實(shí)測(cè)值(理論計(jì)算值)(%):C 74.01 (74.41),H 4.97(5.07),N 7.59(7.89).

采用相同的方法合成了H2P2,產(chǎn)率為75.1%.1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ:-2.755(s,2H,pyrrole N-H),1.542(s,9H,3OCH3),4.631-4.642(t,J=4.4 Hz, 2H,―CH2),4.914-4.933(t,J=7.6 Hz,2H,―CH2), 7.261-7.283(m,J=8.8 Hz,1H,Py-2-H),7.337-7.360 (m,J=9.2 Hz,8H,4Ar-m-H),7.441-7.452(t,J=4.4 Hz,1H,Py-4-H),7.903-8.043(t,J=16.0 Hz,1H, Py-6-H),8.119-8.157(m,J=15.2 Hz,8H,4Ar-o-H), 8.305-8.312(d,J=2.8 Hz,1H,Py-5-H),8.836-8.865 (m,J=11.6 Hz,8H,pyrrole).C55H43N5O6元素分析實(shí)測(cè)值(理論計(jì)算值)(%):C 74.51(75.95),H 4.71 (4.95),N 7.81(8.06).

2.1.4 ZnP1和ZnP2的合成

將76 mg H2P1化合物溶于20 mL CH2Cl2中,加入過飽和的乙酸鋅甲醇溶液10 mL,避光,微微回流1 h,產(chǎn)物由紫色逐漸變成紫紅色,冷卻,水洗,再用二氯甲烷萃取,旋干.以一定比例的二氯甲烷:乙醚(V:V=25:1)配成的混合溶液為淋洗劑,硅膠為固定相,將粗產(chǎn)品進(jìn)行分離,收集主色帶,旋干蒸發(fā)得到紫紅色晶體,產(chǎn)率為92.6%.產(chǎn)物的合成路線見示意圖1.

1H NMR(CDCl3,400MHz),δ:1.562(s,9H, 3OCH3),2.943-2.960(t,J=6.8 Hz,2H,―CH2),4.444-4.463(t,J=7.6 Hz,2H,―CH2),5.567-5.593(m,J= 10.4 Hz,1H,Py-2-H),6.896-6.917(d,J=8.4 Hz,1H, ArO-o-H),7.177-7.220(m,J=17.2 Hz,6H+3H,3Arm-H+ArO-m,p-H),7.956-7.972(t,J=6.4 Hz,1H,Py-4-H),8.040-8.053(t,J=5.2 Hz,1H,Py-6-H),8.132-8.164(m,J=12.8 Hz,6H,3Ar-o-H),8.195-8.201(d, J=2.4 Hz,1H,Py-5-H),8.836-8.855(m,J=7.6 Hz, 8H,Pyrrole).C55H41N5O6Zn元素分析實(shí)測(cè)值(理論計(jì)算值)(%):C 70.46(70.82),H 4.60(4.40),N 7.09 (7.51).

采用相同的方法合成了ZnP2,產(chǎn)率為95.1%.1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ:1.261(d,J=11.6 Hz, 9H,3OCH3),3.901-3.922(t,J=8.4 Hz,2H,―CH2), 4.154-4.173(t,J=7.6 Hz,2H,―CH2),6.274-6.303 (m,J=11.6 Hz,1H,Py-2-H),7.386-7.421(d,J=14.0 Hz,1H,Py-4-H),7.727-7.760(m,J=13.2 Hz,8H, 4Ar-m-H),8.010-8.033(t,J=9.2 Hz,1H,Py-6-H), 8.199-8.237(m,J=15.2 Hz,8H,4Ar-o-H),8.295-8.299(d,J=1.6 Hz,1H,Py-5-H),8.816-8.835(m,J= 7.6 Hz,8H,Pyrrole).C55H41N5O6Zn元素分析實(shí)測(cè)值(理論計(jì)算值)(%):C 70.53(70.82),H 4.75(4.40),N 7.24(7.51).

2.2 主要儀器與試劑

Perkin-Elemer 240元素分析儀(美國);Shimadzu-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);WGY-10型熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展有限公司); Varian 400 M核磁共振儀(TMS,CDCl3,美國);傅里葉變換紅外光譜儀(Prestige-21,日本島津);石英比色皿.

對(duì)甲氧基苯甲醛、水楊醛、對(duì)羥基苯甲醛、吡咯、丙酸、1,2-二溴乙烷、煙酸、二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、二氯甲烷、乙酸鋅、三(羥甲基)氨基甲烷,中性Al2O3(100-200目),硅膠(200-300目),以上試劑均為分析純;人血清白蛋白(HSA,購于中生北控生物科技股份有限公司).實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

紫外-可見光譜的測(cè)定:以二氯甲烷為溶劑,分別配制一定濃度的H2P1、H2P2和ZnP1、ZnP2溶液,進(jìn)行Q譜帶和Soret譜帶的測(cè)定,紫外-可見吸收光譜見圖1、圖2,數(shù)據(jù)見表1.

熒光光譜的測(cè)定:人血清白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量68000)儲(chǔ)備液:1.176×10-5mol·L-1水溶液,工作液為2.50×10-6mol·L-1;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液:0.1 mol·L-1水溶液(pH=7.40).以DMSO為溶劑,配制濃度為2.0×10-4mol·L-1的ZnP1和ZnP2儲(chǔ)備液,工作液濃度范圍為1.0×10-6-3.0×10-5mol· L-1.于10 mL容量瓶中依次加入 pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液1 mL、2.0 mL 2.50×10-6mol·L-1的HSA和不同體積的ZnP1或ZnP2溶液,定容,于一定溫度恒溫水浴中恒溫10 min,掃描各體系的熒光光譜圖.測(cè)試條件:樣品池為1 cm×1 cm×4 cm石英池,激發(fā)狹縫10 nm,發(fā)射狹縫10 nm,激發(fā)波長為286 nm,負(fù)高壓:145 V,掃描范圍:275-450 nm.溫度為15、25、35及45°C.

紅外光譜采用溴化鉀壓片法,在4000-400 cm-1范圍內(nèi)攝譜,主要吸收峰光譜數(shù)據(jù)列于表2.

2.4 計(jì)算方法

量子化學(xué)計(jì)算采用從頭算Hartree-Fock方法和密度泛函理論B3LYP方法,運(yùn)用6-31G(d)計(jì)算基組.17,18先在Hartree-Fock/6-31G(d)級(jí)別上進(jìn)行初步優(yōu)化,再在B3LYP/6-31G(d)級(jí)別上進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化、頻率分析確定穩(wěn)定構(gòu)型,全部計(jì)算用Gaussian 03程序包完成.

示意圖1 ZnP1和ZnP2配合物的合成路線圖Scheme lSynthesis routes of ZnP1and ZnP2complexes

根據(jù)Stern-Volmer方程:19F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+ KSV[Q],計(jì)算體系的猝滅常數(shù).式中:Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)(L·mol-1·s-1);τ0為無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命(τ0=10-8s);KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)(L·mol-1);F0為未加入猝滅劑時(shí)人血清白蛋白的熒光強(qiáng)度;F為金屬卟啉與人血清白蛋白相互作用時(shí)體系的熒光強(qiáng)度;[Q]為淬滅劑金屬卟啉的濃度(mol·L-1).

利用猝滅公式:(F0-F)-1=F0-1+(KF0[Q])-1,19作不同溫度下的Lineweaver-Burk曲線,由直線斜率求得不同溫度下金屬卟啉與HSA的結(jié)合常數(shù)K.

由van?t Hoff方程:20lnK0=-ΔrHm0/RT+ΔrSm0/R,以不同溫度下反應(yīng)體系的lnK0對(duì)1/T作線性回歸,求出反應(yīng)的熵變?chǔ)Sm0、焓變?chǔ)Hm0和自由能變?chǔ)Gm0.

3 結(jié)果與討論

3.1 合 成

文中通過經(jīng)典的Alder-Longo法合成了基礎(chǔ)原料5-鄰羥基苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉和5-對(duì)羥基苯基-10,15,20-三(4-甲氧基苯基)卟啉,合成過程中加熱時(shí)間不易過長,以微回流控制溫度,反應(yīng)體系保持高速攪拌,否則易產(chǎn)生黑色高聚物. H2P1、ZnP1的合成與H2P2、ZnP2的合成相比,產(chǎn)率較低,這可能是受空間位阻效應(yīng)的影響所致.另從H2P1、H2P2及ZnP1、ZnP2的合成表征數(shù)據(jù)可以看出,自由卟啉和金屬卟啉的元素分析數(shù)據(jù)與理論值都非常接近,初步確定所得產(chǎn)物為目標(biāo)化合物.

3.2 紫外-可見吸收光譜

圖1是H2P1、ZnP1在二氯甲烷溶液中濃度分別為2.0×10-6、2.0×10-5mol·L-1時(shí)測(cè)得的Soret帶(圖1曲線a和b)和Q帶(圖1曲線c、d)的紫外吸收光譜.圖2是H2P2在濃度分別為2.0×10-6、2.0×10-5mol·L-1時(shí)測(cè)得的Soret帶(圖2曲線b)、Q帶(圖2曲線e)的紫外吸收光譜和ZnP2濃度分別在1.0×10-7、2.5×10-6、4.0×10-6mol·L-1時(shí)測(cè)得的Soret帶(分別為圖2曲線a、c、d)及濃度在1.0×10-7mol·L-1時(shí)測(cè)得的Q帶(圖2曲線f)的紫外吸收光譜.

圖1 H2P1和ZnP1的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of H2P1and ZnP1(a)H2P1-Soret band;(b)ZnP1-Soret band;(c)H2P1-Q band; (d)ZnP1-Q band

結(jié)合圖1、圖2和表1中數(shù)據(jù)可以看出:(1)H2P1和H2P2的紫外-可見吸收光譜均有一個(gè)Soret帶和四個(gè)Q帶.根據(jù)Gouterman的四軌道模型,21在421.2和421.9 nm處的強(qiáng)吸收是Soret帶,由a1μ(π)-eg(π*)電子躍遷產(chǎn)生,歸屬于卟啉π-π*躍遷的第二電子激發(fā)態(tài);吸收光譜在500-650 nm之間的吸收帶是Q帶,由a2μ(π)-eg(π*)電子躍遷產(chǎn)生,歸屬為卟啉π-π*躍遷的第一電子激發(fā)態(tài);(2)H2P1、H2P2絡(luò)合鋅離子形成ZnP1、ZnP2后,紫外吸收光譜中QI、QIV帶消失.分析引起吸收光譜發(fā)生變化的原因,Zn2+是d10組態(tài)的金屬離子,當(dāng)鋅離子配位于自由卟啉化合物后,卟啉環(huán)內(nèi)形成Zn―N鍵,配合物的對(duì)稱性發(fā)生了變化,由配體的D2h變?yōu)榕浜衔锏腄4h,且能級(jí)靠近,分子軌道的分裂程度減少,簡并度增加,由a2μ(π)-eg(π*)電子躍遷產(chǎn)生的Q帶數(shù)目相應(yīng)減少,表現(xiàn)為QI、QIV譜帶消失,同時(shí)Soret譜帶發(fā)生一定程度的位移,這符合金屬卟啉紫外-可見光譜的吸收特征;22(3)對(duì)于ZnP1來說,與H2P1相比Soret譜帶發(fā)生了較大程度的位移,一般情況下自由卟啉絡(luò)合Zn2+形成鋅卟啉后, Soret譜帶紅移5-6 nm,而ZnP1紅移了近10 nm,原因可能是存在分子內(nèi)的配位作用,我們16曾合成報(bào)道的o-(niacin)C2O-TPPZn配合物中即存在著卟啉環(huán)內(nèi)Zn離子與側(cè)鏈吡啶環(huán)中N原子間的分子內(nèi)配位作用;對(duì)于ZnP2而言,在濃度為1.0×10-7mol·L-1時(shí)測(cè)得的Soret帶圖譜發(fā)生了一定程度的裂分,且隨著溶液濃度增大到4.0×10-6mol·L-1時(shí)(圖2曲線a-d),Soret帶圖譜裂分的程度越來越清晰,這是因?yàn)楫?dāng)卟啉大環(huán)中心絡(luò)合鋅離子后,一個(gè)鋅配合物的中心鋅離子與另一個(gè)鋅配合物煙酸上N原子之間形成了配位作用,也就是說ZnP2分子之間形成了配位作用,師同順等23合成的5-(4-煙酸酰亞胺基)苯基-10,15,20-三苯基卟啉鋅配合物中也存在著側(cè)鏈煙酸中N原子與另一鋅卟啉中鋅離子間的配位作用,形成了二聚體,導(dǎo)致鋅卟啉配合物Soret帶圖譜的裂分.

圖2 H2P2和ZnP2的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of H2P2and ZnP2(a,c,d)ZnP2-Soret band;(b)H2P2-Soret band; (e)H2P2-Q band;(f)ZnP2-Q band

表1 H2P1、H2P2、ZnP1及ZnP2在二氯甲烷中的紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)Table 1 Data of UV-Vis spectra of H2P1,H2P2,ZnP1,and ZnP2in CH2Cl2

3.3 核磁共振氫譜

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并參照文獻(xiàn)16對(duì)自由卟啉H2P1、ZnP1和H2P2、ZnP2的核磁共振氫譜進(jìn)行了歸屬,數(shù)據(jù)列于2.1節(jié)的合成部分.由測(cè)試數(shù)據(jù)可以看出:(1)自由卟啉H2P1和H2P2卟啉環(huán)中N―H鍵的化學(xué)位移分別在-2.852和-2.755處,而在ZnP1和ZnP2中該處峰均消失,說明確實(shí)形成了金屬鋅卟啉配合物;(2) H2P1和H2P2吡啶環(huán)中H的化學(xué)位移分別在6.277-6.303、7.856-7.872、8.030-8.063、8.295-8.302及7.261-7.283、7.441-7.452、7.903-8.043、8.305-8.312處,與鋅離子配位形成ZnP1和ZnP2后吡啶環(huán)中H的化學(xué)位移分別在5.567-5.593、7.956-7.972、8.040-8.053、8.195-8.201及 6.274-6.303、7.386-7.421、8.010-8.033、8.295-8.299處,而文獻(xiàn)24中煙酸負(fù)離子中H的化學(xué)位移在7.41、8.15、8.49、8.83處.與之對(duì)比,金屬卟啉中吡啶環(huán)上H的化學(xué)位移均向高場進(jìn)行了移動(dòng),這是因?yàn)閆nP1和ZnP2中Zn2+除與卟啉環(huán)中N原子配位外,還與吡啶環(huán)中N原子形成了配位作用,這使得卟啉環(huán)的a2μ(π)軌道能量增加,與eg(π*)間的能量差減小,激發(fā)能降低,因此躍遷吸收譜帶明顯向長波長方向移動(dòng),從而造成Soret帶的紅移.23,25-27

3.4 紅外光譜

根據(jù)文獻(xiàn)16對(duì)自由卟啉及其鋅配合物的紅外特征吸收光譜進(jìn)行了經(jīng)驗(yàn)歸屬,數(shù)據(jù)列于表2中.由表2可以看出,H2P1和H2P2中羰基的特征吸收峰分別出現(xiàn)在1720.45、1718.58 cm-1處,在1350.17、1347.94 cm-1處分別有酯鍵的典型特征吸收峰,表明煙酸負(fù)離子以成酯的方式與卟啉側(cè)端的乙氧鏈相連接生成了新的化合物.

再觀察表2,H2P1和H2P2中的N-H伸縮振動(dòng)吸收帶分別出現(xiàn)在3410.15、738.74 cm-1及3420.42、735.79 cm-1處,在其所對(duì)應(yīng)的鋅配合物ZnP1和ZnP2中,這兩條譜帶均消失,同時(shí)分別在993.34、995.68 cm-1處生成了一個(gè)新的強(qiáng)伸縮振動(dòng)吸收峰,該峰歸屬于卟啉環(huán)內(nèi)Zn―N配位鍵的振動(dòng)吸收峰.這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,卟啉環(huán)內(nèi)的兩個(gè)氫原子被鋅離子取代后形成了穩(wěn)定的金屬卟啉配合物.

3.5 量子化學(xué)計(jì)算

通過頻率分析計(jì)算得出勢(shì)能面上的穩(wěn)定構(gòu)型見圖3.表3中列出了金屬鋅卟啉穩(wěn)定構(gòu)型的能量、前線軌道數(shù)據(jù)(最高占據(jù)軌道(HOMO)、最低空軌道(LUMO))以及二者的能級(jí)差ΔELUMO-HOMO=ELUMO-EHOMO)及中心金屬離子Zn2+和側(cè)鏈基團(tuán)吡啶環(huán)中N原子上的電荷.

表2 紅外特征吸收光譜數(shù)據(jù)(cm-1)Table 2 Data of IR spectroscopy(cm-1)

圖3 金屬卟啉的穩(wěn)定構(gòu)型Fig.3 Stable configurations of metalloporphyrins(a)ZnP2;(b)ZnP1-1;(c)ZnP1-2

表3 量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果Table 3 Calculation results of quantum chemistry

圖3a是ZnP2的穩(wěn)定構(gòu)型.由穩(wěn)定構(gòu)型可以看出,側(cè)鏈基團(tuán)遠(yuǎn)離卟啉環(huán)平面.結(jié)合ZnP2的實(shí)驗(yàn)合成方法,側(cè)鏈基團(tuán)中吡啶環(huán)是通過柔性鏈―CH2―CH2―與卟啉環(huán)連接,吡啶環(huán)中N原子具有與另一鋅卟啉分子中的鋅離子形成分子間配位的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn).

圖3b是ZnP1中側(cè)鏈與卟啉環(huán)之間沒有相互作用時(shí)的穩(wěn)定構(gòu)型(標(biāo)記為ZnP1-1);圖3c是ZnP1中側(cè)鏈吡啶環(huán)中N原子與卟啉環(huán)中鋅離子之間形成分子內(nèi)配位作用時(shí)的穩(wěn)定構(gòu)型(標(biāo)記為ZnP1-2).結(jié)合表3中數(shù)據(jù),圖3c構(gòu)型比圖3b構(gòu)型的能量低(24.75 kJ·mol-1),表明圖3c構(gòu)型更穩(wěn)定.根據(jù)前線軌道理論,體系的LUMO和HOMO的能量差ΔELUMO-HOMO越大,則體系越穩(wěn)定.28圖3c構(gòu)型中ΔELUMO-HOMO比圖3b構(gòu)型中ΔELUMO-HOMO大,由此確定圖3c構(gòu)型比圖3b構(gòu)型更穩(wěn)定,這與能量的分析結(jié)果是一致的.

從電荷分布的角度考慮,與圖3b構(gòu)型相比,圖3c構(gòu)型中的Zn2+帶更多的正電荷,而側(cè)鏈煙酸中N原子上帶更多的負(fù)電荷,說明Zn2+和N原子能夠形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵,測(cè)量的鍵長為0.2201 nm,表明Zn2+和N原子具有很強(qiáng)的相互作用,這種配位作用降低了整個(gè)體系的能量,從而使體系更穩(wěn)定.由此可進(jìn)一步確定ZnP1中Zn2+除與卟啉環(huán)中四個(gè)N原子配位之外,還存在著與側(cè)鏈基團(tuán)吡啶環(huán)中N原子之間的配位作用,也就是說ZnP1中Zn2+形成了五配位.

綜合分析紫外-可見吸收光譜、核磁共振氫譜和量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果,ZnP1中側(cè)鏈煙酸基團(tuán)鍵連在卟啉環(huán)的鄰位,處于卟啉環(huán)上方,形成了分子內(nèi)配位,而ZnP2中側(cè)鏈煙酸基團(tuán)鍵連在卟啉環(huán)的對(duì)位,處于卟啉環(huán)較遠(yuǎn)的位置,形成了分子間配位.

3.6 熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)

3.6.1 ZnP1對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理

圖4是25°C條件下不同濃度的ZnP1滴定一定濃度的HSA所得到的熒光光譜變化曲線圖.以λex= 286 nm激發(fā),HSA在349.0 nm處有很強(qiáng)的熒光蜂(圖4曲線a),而ZnP1的熒光峰位處于630.4、667.8 nm.由圖可以看出,當(dāng)不同濃度的ZnP1滴定一定濃度的HSA時(shí),反應(yīng)體系的熒光曲線與HSA和ZnP1相比,熒光強(qiáng)度均發(fā)生了較大變化,說明ZnP1與HSA之間存在著一定的相互作用;并且隨著加入ZnP1濃度的不斷增加,所形成體系的熒光曲線呈現(xiàn)出不斷降低的趨勢(shì),即產(chǎn)生了熒光猝滅效應(yīng).在15、35及45°C條件下,不同濃度的ZnP1滴定一定濃度的HSA所得到的熒光光譜也有相同的變化趨勢(shì).

圖4 25°C時(shí)ZnP1與HSA相互作用的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra between ZnP1and HSAat 25°C(a)HSA,2.50×10-6mol·L-1;[ZnP1]/(mol·L-1)(b)1.0×10-6; (c)2.0×10-6;(d)4.0×10-6;(e)6.0×10-6;(f)1.0×10-5;(g)1.5×10-5; (h)2.0×10-5;(i)2.5×10-5;(j)3.0×10-5;λex=286 nm

圖5 HSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線圖Fig.5 Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of HSAT/°C:(a)15;(b)25;(c)35;(d)45

3.6.2 熒光猝滅理論

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)等熒光體與其他物質(zhì)相互作用而導(dǎo)致熒光體熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用.熒光猝滅過程通常有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類.靜態(tài)猝滅過程遵從Stern-Volmer方程[F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]]和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線方程[(F0-F)-1=F0-1+(KF0[Q])-1].29

3.6.3 猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)的計(jì)算

為了判斷ZnP1對(duì)HSA熒光的猝滅機(jī)理,根據(jù)溫度為15、25、35和45°C時(shí)ZnP1與HSA相互作用的熒光光譜圖,利用Stern-Volmer方程以F0/F-[Q]作圖得到了不同溫度下ZnP1對(duì)人血清白蛋白的熒光猝滅Stern-Volmer曲線(見圖5).由圖5可以看出,在不同溫度下得到的Stern-Volmer曲線均有良好的線性關(guān)系,這是靜態(tài)猝滅的跡象之一.同時(shí),根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算也得到了不同溫度下的熒光猝滅常數(shù)Kq,數(shù)值列于表4中.不同溫度下ZnP1對(duì)HSA熒光猝滅速率常數(shù)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大猝滅速率常數(shù)Kq值2.0×1010L·mol-1· s-1,并且隨溫度的升高,ZnP1對(duì)HSA的熒光猝滅速率常數(shù)呈現(xiàn)出了不斷下降的趨勢(shì).綜合這些因素, ZnP1對(duì)HSA的熒光猝滅是分子間形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅.29

圖6 HSA熒光猝滅的Lineweaver-Burk曲線圖Fig.6 Lineweaver-Burk curves of fluorescence quenching of HSAT/°C:(a)45;(b)35;(c)25;(d)15

再利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線方程以作圖,得到了不同溫度下ZnP1對(duì) HSA的熒光猝滅Lineweaver-Burk曲線(見圖6),并根據(jù)Lineweaver-Burk方程計(jì)算出了ZnP1與HSA之間的結(jié)合常數(shù)K,數(shù)據(jù)列于表4中,K值的大小表明二者之間的結(jié)合作用較強(qiáng),說明合成的ZnP1可以在體內(nèi)被蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和運(yùn)輸.

3.6.4 熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

由van?t Hoff方程以不同溫度下反應(yīng)體系的lnK0對(duì)1/T作線性回歸(線性相關(guān)系數(shù)r=0.9996),求得熵變?chǔ)Sm0=-10.58 J·K-1、焓變?chǔ)Hm0=-30.47 kJ·moL-1和自由能變?chǔ)Gm0=-27.32 kJ·moL-1.這些熱力學(xué)函數(shù)數(shù)據(jù)說明兩者之間發(fā)生了化學(xué)反應(yīng),且反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行.再根據(jù)Ross等30總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律:ΔH＞0、ΔS＞0時(shí),屬于疏水作用力;ΔH＜0、ΔS＜0時(shí),屬于氫鍵或van der Waals力;ΔH≈0、ΔS＞0時(shí),屬于靜電引力.文中研究體系的ΔH和ΔS均小于0,由此得出結(jié)論:所合成的ZnP1與HSA主要是以氫鍵或van der Waals力結(jié)合反應(yīng)的,也就是說ZnP1進(jìn)入了HSA的疏水腔.

表4 不同溫度下ZnP1對(duì)HSA的熒光猝滅常數(shù)Kq、結(jié)合常數(shù)K及線性相關(guān)系數(shù)rTable 4 Quenching constants Kq,binding constants K,and linear correlation coefficient r between ZnP1and HSAat different temperatures

-F)-1versus[Q]-1.

對(duì)于ZnP2與人血清白蛋白相互作用時(shí)的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)等數(shù)據(jù)與ZnP1相比沒有出現(xiàn)較大的變化,由此看來相同基團(tuán)鍵連卟啉環(huán)位置的差異對(duì)與人血清白蛋白的相互作用未造成較大的影響.

4 結(jié)論

通過親核取代反應(yīng)合成了含有煙酸分子修飾的自由卟啉o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP、p-(niacin) C2O-T(3p-OCH3)PP及鋅配合物o-(niacin)C2O-T(3p OCH3)PPZn、p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn.經(jīng)元素分析、紫外-可見光譜、核磁共振氫譜、紅外光譜等多種譜圖對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn存在著分子內(nèi)的Zn-N配位作用,而p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn中存在著分子間的Zn-N配位作用.熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)顯示,具有生物活性功能的煙酸分子修飾合成的金屬鋅卟啉對(duì)人血清白蛋白的熒光具有良好的猝滅作用,該猝滅過程為靜態(tài)猝滅,鋅卟啉與HSA之間是以氫鍵或van der Waals力結(jié)合反應(yīng).這些研究結(jié)果為獲取蛋白質(zhì)分子的信息,了解卟啉類藥物在體內(nèi)的作用機(jī)理,提供了一些具有理論和應(yīng)用價(jià)值的信息.

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November 29,2011;Revised:February 1,2012;Published on Web:February 22,2012.

Synthesis of Tailed Porphyrin Modified with Nicotinic Acid and Interactions with Human Serum Albumin

PENG Yu-Ling WANG Shu-Jun*FU Li ZHANG Cheng-Gen LIU Xin-Gang
(College of Chemistry&Material Science,Langfang Teachers College,Langfang 065000,Hebei Province,P.R.China)

Free porphyrins,namely o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP and p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PP,their complexes,o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn and p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn modified with nicotinic acid,were designed,synthesized,and characterized by elementary analysis,and UV-Vis,1H nuclear magnetic responance(1H NMR),and infrared(IR)spectroscopies.The conformations of the Zn porphyrins were calculated using a quantum-chemical method.The experimental results showed the following.It was found that the nicotinic acid group was on the porphyrin plane in o-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn and Zn―N intramolecular coordination interactions which existed between the N atom of the nicotinic acid group in the side-chain and the Zn2+in the porphyrin plane.The nicotinic acid group was far from the porphyrin plane in p-(niacin)C2O-T(3p-OCH3)PPZn and Zn―N intermolecular coordination interactions which existed between the N atom of the nicotinic acid group in one Zn porphyrin and the Zn2+in the other porphyrin plane.The fluorescence properties of the interactions between Zn porphyrins and human serum albumin (HSA)were studied using fluorescence spectroscopy.There is a large quenching interaction between the Zn porphyrins and human serum albumin.The mechanism of the combination reaction is hydrogen bonding or van der Waals interactions between the Zn porphyrins and human serum albumin.The fluorescence quenching data were analyzed using the Stem-Volmer equation and a double-reciprocal equation,and the quenching constant,binding constant,and thermodynamic parameters were obtained.

Nicotinic acid;Zn porphyrin;Human serum albumin;Fluorescence quenching; Thermodynamic parameter

10.3866/PKU.WHXB201202222

?Corresponding author.Email:d022036@mail.nankai.edu.cn;Tel:+86-13930694702.

The project was supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province,China(B2010001803)and Specialized Research Fund for the Program of Langfang Teachers College,China(LSZZ201003).

河北省自然科學(xué)基金(B2010001803);廊坊師范學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)專項(xiàng)基金(LSZZ201003)資助

O641;O621.22;O621.24