加麗素紅中角黃素在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

田 洋 楊蘭蘭 徐昆龍* 肖 蓉 李 棟 何夢恒 史崇穎

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

加麗素紅為瑞士羅氏公司生產(chǎn)的化學(xué)合成類飼料著色劑，有效成分為10%的角黃素［1］，主要用于增加家禽皮膚、腳脛、蛋黃以及水產(chǎn)動物體表、肌肉組織的色澤，已被廣泛應(yīng)用在我國蛋禽飼糧和三黃雞飼糧中，使用率達到60%左右［2］。國內(nèi)市場上出現(xiàn)的“紅心蛋”就是由于飼糧中添加了加麗素紅致使蛋黃呈現(xiàn)誘人的紅色。隨著一些報紙、網(wǎng)站等新聞媒體對“紅心蛋”各種評論的不斷升溫，加麗素紅在飼料中使用的安全性引起了消費者的高度關(guān)注［3］。

角黃素(又叫斑蝥黃，斑蝥黃質(zhì)，canthaxanthin)為一種非維生素A原酮式類胡蘿卜素，分子式為C40H52O2，相對分子質(zhì)量為 564.9，化學(xué)名稱為β，β'－ 胡蘿卜素 －4，4'－ 二酮［4－5］。2008 年我國農(nóng)業(yè)部公布的第1 126號文件中允許使用的8種著色劑中包含角黃素，并規(guī)定了適用范圍為家禽［6］。近年來，角黃素作為飼料著色劑濫用現(xiàn)象日益嚴重，其危害性引起了各國的高度重視，揭示角黃素在動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)參數(shù)是產(chǎn)生、決定或闡明其毒性大小的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外關(guān)于角黃素在動物體內(nèi)藥代動力學(xué)特征的研究較少，且大部分集中在虹鱒魚等水產(chǎn)動物上，關(guān)于對其在家禽體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征卻鮮見報道。

本研究利用藥物代謝動力學(xué)的方法，通過不同時間測定雞血清中角黃素的質(zhì)量濃度，求出相應(yīng)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，從而闡明其在雞體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)特征，以期為加麗素紅在毒理學(xué)方面的研究及其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

加麗素紅，含10%角黃素，瑞士羅氏公司;角黃素標準品，批號CA10947000，純度為96.0%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈、正丙醇、正己烷、N，N－二甲基甲酰胺、無水硫酸鈉均為色譜純。

1.2 儀器

Vortex genius 3旋渦混勻器，德國IKA公司;3－30K冷凍離心機，德國Sigma公司;TH2－320臺式恒溫振蕩器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Waters2695高效液相色譜儀附紫外檢測器，美國Waters公司;HR2864飛利浦三合一攪拌器，荷蘭皇家飛利浦電子公司;SB3200超聲波清洗儀，美國伯明斯頓公司;BUCHI R－200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司;T－4002電子分析天平，美國丹佛儀器公司。

1.3 試驗動物

選用12只健康的19周齡海蘭白殼蛋雞為研究對象，平均體重為(1.25±0.09)kg，購買于云南昆明某雞場。在封閉的動物房，飼養(yǎng)于雛雞籠中，自由飲水和采食。

1.4 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧為玉米－豆粕型，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.5 給藥及樣品采集

加麗素紅懸液經(jīng)口灌胃給予雞的劑量為9.6 mg/kg BW，給藥前禁食12 h，自由飲水。采血時間分別為給藥后的 1、2、4、6、8、10、12、24、36、72 h，翅靜脈采血，血樣置于刻度試管中，放置成斜面，放入 37℃水浴鍋中作用 30 min，然后以4 000 r/min離心10 min，即得血清。血清樣品置－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品處理

準確吸取血清1.0 mL于50 mL離心管中，加入30 mL乙腈和3 g無水硫酸鈉，旋渦混勻1 min，振蕩10 min，超聲1 min，然后以3 000 r/min離心5 min，將上清液移入預(yù)置有20 mL正己烷的分液漏斗中，混勻后靜置分層;收集下層乙腈相。按上述步驟對離心管中殘留物每次用20 mL乙腈再重復(fù)提取2次，合并3次提取乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。

準確吸取5 mL乙腈，至于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，超聲1 min，充分混勻內(nèi)容物置于測定瓶內(nèi)，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后直接上機測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.7 數(shù)據(jù)處理

將試驗所得血藥濃度數(shù)據(jù)采用中國藥理學(xué)數(shù)學(xué)專業(yè)委員會編制的3P97藥物代謝動力學(xué)程序軟件，在微機上進行曲線擬合，以Akaike’s信息數(shù)據(jù)的最小信息準則(AIC)值、殘差平方和(Re)和擬合度(r2)為標準確定最佳房室模型，并計算出藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞血清中角黃素質(zhì)量濃度的測定結(jié)果

雞口服給予加麗素紅后角黃素在血清中的質(zhì)量濃度測定結(jié)果見表2。同時測定了不同雞血清中的角黃素質(zhì)量濃度，其結(jié)果標準差較小，說明加麗素紅中角黃素在不同雞體內(nèi)的代謝過程較為穩(wěn)定。

表2 雞口服給予加麗素紅(9.6 mg/kg BW)后角黃素在血清中的質(zhì)量濃度Table 2 Canthaxanthin concentration in serum of chickens following oral administration of Carophyll Red at a dose of 9.6 mg/kg BW

2.2 加麗素紅中角黃素的血藥濃度－時間曲線

雞口服給予加麗素紅后角黃素在其體內(nèi)的血藥濃度 －時間曲線見圖1?？芍u口服9.6 mg/kg BW加麗素紅后，首先進入吸收相，給藥后1 h可檢測到角黃素，在0～10 h，血清中角黃素濃度迅速上升，達峰時間為10 h，峰濃度為(0.362±0.015)μg/mL;隨后進入消除相，在10～24 h，血清中角黃素濃度迅速下降到(0.108±0.005)μg/mL，在 24 ～72 h，下降變得緩慢。

圖1 雞口服給予加麗素紅后角黃素在其體內(nèi)的血藥濃度－時間曲線Fig.1 Serum drug concentration-time curve of canthaxanthin concentration in serum of chickens following oral administration of Carophyll Red

2.3 房室模型的選擇

為驗證房室數(shù)，本試驗用Akaike’s信息數(shù)據(jù)法的AIC值、Re和r2的方法對于一室及二室的契合程度進行了比較(表3)?？芍?，一室與二室模型比較后的Re值以一室為小，r2值以一室為大，AIC值以一室為小，因此3種方法均表明雞口服加麗素紅后角黃素的血藥濃度－時間數(shù)據(jù)屬一室模型。

表3 3種方法對角黃素一室及二室契合程度的比較Table 3 Comparison one-compartment model to two-compartment model with three methods

2.4 藥代動力學(xué)參數(shù)

用3P97藥動學(xué)軟件對各時間點血清中角黃素質(zhì)量濃度進行數(shù)據(jù)處理后發(fā)現(xiàn)(表4)，加麗素紅經(jīng)雞口服后，角黃素在雞體內(nèi)的代謝過程可按一室模型一級動力學(xué)擬合，其理論方程為C=0.471(e－0.036－ e－0.190)，藥代動力學(xué)的主要參數(shù)為:吸收半衰期 t1/2(Ka)=(3.643 ±0.205)h，消除半衰期 t1/2(Ke)=(19.263 ±1.312)h，達峰時間Tmax=(10.795 ± 1.007)h，達 峰濃度 Cmax=(0.259±0.048)μg/mL，血藥濃度 － 時間曲線下面積 AUC=(10.607 ±1.029)μg/(mL·h)，總體清除率 CLB=(0.905 ±0.076)L/(kg·h)，表觀分布容積 Vd=(2.515±0.133)L/kg。結(jié)果表明角黃素在雞體內(nèi)吸收迅速，較快達到峰濃度，分布廣泛，消除較慢。

表4 雞口服給予加麗素紅后其角黃素的藥代動力學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of canthaxanthin in chickens following oral administration of Carophyll Red

3 討論

角黃素作為一種飼料著色劑被廣泛用于我國蛋雞飼料中，主要增加雞的腳脛、皮膚以及蛋黃的顏色，使其呈現(xiàn)鮮艷的誘人色澤，增加其商業(yè)價值。本試驗選用19周齡已經(jīng)產(chǎn)蛋的海蘭蛋雞(產(chǎn)蛋的平均周齡為18周)為研究對象，符合角黃素在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的實際使用情況，因此對于闡明角黃素在雞體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征更具有現(xiàn)實意義。

Nierenberg［7］和 Sapuntzakis 等［8］報道了血清中類胡蘿卜素的含量比血漿中類胡蘿卜素的含量高了10%，為了提高試驗過程的準確性和精密度，應(yīng)選用雞的血清來進行試驗。

本試驗中所得的血藥濃度－時間數(shù)據(jù)經(jīng)3P97軟件分析處理，分別按一室、二室模型進行模擬，根據(jù)AIC值、Re值和r2值，確定雞口服加麗素紅后，角黃素在體內(nèi)的代謝過程符合一級吸收一室模型。Gobantes等［9］報道了加麗素紅經(jīng)口服給予虹鱒魚后，角黃素在其體內(nèi)也符合一級吸收一室模型，這說明角黃素在不同的動物體內(nèi)代謝方式基本相似，都為一級吸收一室模型。

Tmax是指藥物經(jīng)血管外給藥吸收后達到藥峰濃度所需的時間，是反映藥物在體內(nèi)吸收速率的一個重要指標，與吸收速率常數(shù)相比，它能更直觀和準確地反映出藥物的吸收速率，因此更具有實際意義［10］。雞單劑量口服給予加麗素紅后血清中角黃素質(zhì)量濃度的最高峰出現(xiàn)在10 h，而在虹鱒魚和牛的動物體內(nèi)達峰時間分別為12和8 h，在人體內(nèi)達峰時間為 6 h［9，11－13］，這說明角黃素在雞體內(nèi)的吸收速率要快于虹鱒魚，而慢于牛和人，這可能與動物的種屬有很大關(guān)系，但其他的因素也可能會影響這一結(jié)果，比如給予藥物的劑型、動物的生長環(huán)境(pH和溫度)以及能夠使動物生理狀態(tài)發(fā)生變化的外界因素等［9］。

t1/2(Ka)是指藥物經(jīng)口服后消化道吸收了藥物1/2所需要的時間;t1/2(Ke)是指藥物在體內(nèi)消除1/2所需要的時間，即血藥濃度下降1/2所需要的時間。角黃素在雞體內(nèi)的t1/2(Ka)比在虹鱒魚中的t1/2(Ka)低了27.29%，而t1/2(Ke)卻比虹鱒魚的t1/2(Ke)高了52.52%［9］，說明角黃素在雞體內(nèi)吸收迅速，但是消除半衰期卻慢于虹鱒魚;同時Choubert等［14］研究發(fā)現(xiàn)角黃素經(jīng)靜脈注射到虹鱒魚體內(nèi)后的消除速度要比經(jīng)口服給予虹鱒魚后的消除速度快約4倍，這可能是由于口服給藥后角黃素要經(jīng)過胃腸道的吸收后才進入血液循環(huán)，延長了角黃素在雞體中滯留的時間。

藥物消除是指促使藥物由體內(nèi)喪失(代謝和排泄)的各種過程的總和。角黃素作為一種非維生素A原的類胡蘿卜素在雞體內(nèi)不能合成維生素A，本試驗中未發(fā)現(xiàn)角黃素發(fā)生降解的現(xiàn)象，提示角黃素在雞體內(nèi)的消除可能大部分是通過排泄方式完成的，這與文獻報道的角黃素經(jīng)口服后在動物體內(nèi)只有3% ～8%被吸收、糞便排泄是主要的消除途徑(比如猴子中85%～89%的角黃素經(jīng)糞便排出體外)的研究結(jié)果［15］相一致。

CLB是指體內(nèi)諸消除器官在單位時間內(nèi)消除藥物的血漿容積，是肝臟、腎臟、肺臟以及其他消除途徑消除率的總和，與動力學(xué)模型無關(guān)。在描述藥物消除中，CLB考慮到表觀分布容積和消除半衰期兩者的變化，是一個比消除半衰期更有用的藥物消除測量指數(shù)［16－18］。本試驗中角黃素在雞體內(nèi)的CLB為0.905 L/(kg·h)，而虹鱒魚中角黃素的CLB為0.0173 L/(kg·h)，說明角黃素在雞體中的總體清除速率要高于虹鱒魚。但由圖1可知，角黃素經(jīng)口服灌胃后，在10～24 h，血清中角黃素濃度迅速減少，而24 h后其濃度在血清中清除非常緩慢，基本維持穩(wěn)定。綜合分析，角黃素在雞體內(nèi)的消除速度較慢。

Vd值是指體內(nèi)藥物總量待平衡后，按測得的血漿藥物濃度計算時所需的體液總體積。它的大小可以反映藥物分布的廣泛程度。如果藥物在體內(nèi)均勻分布，當Vd值大于1.0 L/kg時，則藥物的組織濃度高于血漿濃度，藥物在體內(nèi)分布廣泛，或者組織蛋白對藥物有高度結(jié)合［10，17］。本試驗中經(jīng)口服給予雞角黃素后發(fā)現(xiàn)，Vd值(2.515 L/kg)約高于虹鱒魚中Vd值的12倍，這一結(jié)果提示了角黃素在雞體內(nèi)分布可能非常廣泛。Tyczkowski等［19］的報道也驗證了這一推論，他們研究發(fā)現(xiàn)角黃素經(jīng)口服給予雞后能夠在空腸、大腸、血清、肝臟、腳趾、肌肉、脂肪、皮膚、卵巢等組織器官中檢出。

AUC與吸收后體循環(huán)的藥量成正比例，它反映進入體循環(huán)藥物的相對量，是計算生物利用度的 基 礎(chǔ) 數(shù) 值［10］。 本 試 驗 中 AUC 為10.607μg/(mL·h)，明 顯 低 于 虹 鱒 魚 中 的52.9μg/(mL·h)，但由于給藥劑量、劑型等因素不同，所以還不能說明雞體中角黃素的吸收率一定低于虹鱒魚。要比較角黃素在不同動物體內(nèi)的吸收率還需要計算經(jīng)靜脈注射后角黃素的AUC值，從而求出生物利用率進行比較。

4 結(jié)論

加麗素紅經(jīng)雞口服后，角黃素在雞體內(nèi)的代謝過程符合一級吸收一室模型，且具有吸收迅速、較快達到峰濃度、在組織器官中分布廣泛、體內(nèi)消除速度較慢等特點。

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