代謝組學(xué)及其在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用

劉秀勤 王德才 (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

代謝組學(xué)〔1〕是通過考察生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受刺激或擾動后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)代謝產(chǎn)物圖譜及其動態(tài)變化，研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興“組學(xué)”。與其他三種組學(xué)研究的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子不同，代謝組學(xué)是對生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究。近年來，代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用到毒理學(xué)〔2〕、營養(yǎng)學(xué)〔3〕、植物學(xué)〔4〕、微生物學(xué)〔5〕、藥物研發(fā)〔6〕、疾病研究〔7〕、功能基因組學(xué)〔8〕等領(lǐng)域。阿爾茨海默病(AD)是一種原因不明的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，典型病理改變?yōu)槔夏臧吆蜕窠?jīng)纖維纏結(jié)的形成。AD病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制至今仍然不明。近年來，一些學(xué)者〔9〕對AD的生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了研究，希望能夠找到早期診斷AD的標(biāo)志物并探明其發(fā)病機(jī)制。代謝組學(xué)運(yùn)用高通量、高敏感的分析技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，分析體液中的代謝產(chǎn)物，可以將所有代謝物的信息整合到一起，通過比較其代謝特性，尋找出早期敏感的生物標(biāo)志物，能夠幫助分析病變過程和輔助臨床診斷。本文就代謝組學(xué)及其在AD生物標(biāo)志物研究中的現(xiàn)狀做一綜述。

1 代謝組學(xué)的研究概況

代謝組學(xué)多應(yīng)用在藥物研發(fā)和疾病研究等領(lǐng)域研究動物體液或組織。Fiehn等〔1〕將其定義為對限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析，多應(yīng)用于植物和微生物領(lǐng)域研究細(xì)胞的代謝組學(xué)。代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒒蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，從而使檢測更為容易。根據(jù)研究對象和研究目的的不同，F(xiàn)iehn〔10〕將代謝組學(xué)分為代謝物靶標(biāo)分析、代謝輪廓分析、代謝組學(xué)及代謝物指紋分析等四個(gè)層次，研究的樣品主要包括尿液、血液、唾液以及細(xì)胞或組織的提取液等。代謝組學(xué)的研究一般包括樣品的采集和制備、代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)志物識別和途徑分析等步驟〔11〕。

1.1 樣品的采集及制備 在采集樣品之前，就要設(shè)計(jì)好樣本的采集時(shí)間、種類、部位、樣本量和采集樣品的器材等，并且采集樣品時(shí)要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制，盡可能在相同的條件下采集樣本，使實(shí)驗(yàn)誤差減到最小。代謝產(chǎn)物的變化會影響分析結(jié)果，處理樣品時(shí)應(yīng)抑制殘留酶的活性，避免發(fā)生氧化，采用冰凍、液氮降溫或冷凍干燥技術(shù)保存樣品〔12〕。根據(jù)研究目的和分析技術(shù)的不同，樣品預(yù)處理的方法也各不相同。磁共振(NMR)分析技術(shù)對樣品的處理比較簡單，控制樣品的pH值、選用不同的緩沖液即可〔13〕。氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)需對揮發(fā)性較小的化合物進(jìn)行衍生化，以增加其揮發(fā)性，擴(kuò)大化合物的檢測范圍〔13〕。高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)通常根據(jù)樣品的性質(zhì)以及相似相溶原理，利用水和有機(jī)溶劑(甲醇、己烷等)分別提取，從而把非極性和極性物質(zhì)分開〔14〕。由于特定的提取條件只適于某類化合物，目前尚無一種普適性的提取方法，故應(yīng)根據(jù)不同的化合物選擇不同的預(yù)處理方法制備樣品。

1.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的采集 樣本預(yù)處理后，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒z測其中的代謝產(chǎn)物，進(jìn)行代謝組數(shù)據(jù)的采集。目前多種分析技術(shù)〔15〕(色譜、質(zhì)譜、NMR、電化學(xué)、毛細(xì)管電泳等)已經(jīng)應(yīng)用到代謝組學(xué)的研究中，表1比較了代謝組學(xué)研究中常用分析技術(shù)的各自優(yōu)勢和適用范圍。其中色譜-質(zhì)譜方法兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性，1HNMR對含氫的代謝產(chǎn)物具有普適性，因此，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和NMR技術(shù)是目前代謝組學(xué)研究中最主要的分析工具〔16〕。

表1 代謝組學(xué)研究中常用分析技術(shù)的比較

1.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的分析 由分析儀器獲得的元數(shù)據(jù)經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理〔21〕(包括濾噪、峰檢測、峰匹配、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化和重疊峰解析等)得到大量的多維的數(shù)據(jù)信息，需進(jìn)一步借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對代謝物進(jìn)行全面分析。最常用的是模式識別技術(shù)，包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法〔16〕主要用于從原始譜圖信息或預(yù)處理后的信息中對樣品進(jìn)行分類，不需相關(guān)樣品分類的任何背景信息，并將獲得的分類信息與樣本的原始信息進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系，篩選出相關(guān)的標(biāo)記物，考察其代謝途徑，主要包括主成分分析(PCA)〔22〕、聚類分析(CA)〔23〕、非線性映射(NLM)〔24〕等。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法〔16〕主要用于類別間的分類，使各類樣品間達(dá)到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對未知的樣本進(jìn)行預(yù)測。主要包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)〔25〕、偏最小二乘法(PLS)〔26〕、偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)〔27〕等。其中PCA和PLSDA是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識別方法，這兩種方法通常以得分圖獲得對樣品分類的信息，載荷圖獲得對分類有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小，從而用于發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的變量〔16〕。代謝組學(xué)分析還需要各種代謝途徑和生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中每種代謝產(chǎn)物都有其相應(yīng)的化學(xué)、臨床、分子生物學(xué)和生化數(shù)據(jù)〔16〕。檢索相關(guān)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫，同時(shí)結(jié)合醫(yī)學(xué)生物學(xué)相關(guān)理論，向代謝終點(diǎn)的上游追溯，能夠探索出生物標(biāo)志物的代謝途徑或通路，進(jìn)而了解疾病的發(fā)病機(jī)制。一些生化數(shù)據(jù)庫〔28〕如連接圖數(shù)據(jù)庫 (Connections Map DB)、京都基因與基因組百科全書 (KEGG)、METLIN、I-RIS、AraCyc、PathDB、生物化學(xué)途徑(ExPASy)、Duke博士植物化學(xué)和民族植物學(xué)數(shù)據(jù)庫、Arizona大學(xué)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫等，可供未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定或用于已知代謝物的生物功能解釋〔11〕。包含生物體代謝物組信息以及代謝物定量數(shù)據(jù)較多的數(shù)據(jù)庫有人類代謝組數(shù)據(jù)庫、ChemSpider數(shù)據(jù)庫，但目前尚無功能完備的數(shù)據(jù)庫。

2 AD概述

2009年AD國際組織發(fā)布目前全世界有3 500多萬癡呆癥患者，未來患者人數(shù)將每20年翻一番。國際上，將老年期癡呆分為AD、血管性癡呆和混合性癡呆等，其中60% ～80%為AD患者〔29〕。AD典型病理改變?yōu)榇竽X皮層及腦區(qū)的纖維蛋白沉積，即細(xì)胞外間隙的β淀粉樣蛋白(Aβ)和細(xì)胞內(nèi)多聚Tau蛋白的沉積，兩者在病理形態(tài)學(xué)上分別表現(xiàn)為老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。AD是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是有多種學(xué)說〔30〕，如基因突變和多態(tài)性學(xué)說、膽堿能假說、tau蛋白學(xué)說、Aβ沉積假說、應(yīng)激適應(yīng)性衰竭假說、自由基損害假說、炎癥機(jī)制假說等。

AD起病隱匿，進(jìn)展緩慢，逐漸表現(xiàn)出記憶力下降、認(rèn)知功能損害、精神行為異常等癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯癡呆癥狀時(shí)臨床診斷沒有太大困難，但此時(shí)病情已無法逆轉(zhuǎn)，失去了治療時(shí)機(jī)。AD在發(fā)病早期一些分子靶標(biāo)的改變早于其病理改變，更早于臨床癥狀的出現(xiàn)〔31〕，為此，國內(nèi)外研究者采用不同的檢測方法和技術(shù)〔32〕對AD可能的生物標(biāo)志物進(jìn)行了大量的研究，但是到目前為止，還沒有找到一種可靠的、特異的、早期敏感的AD生物標(biāo)志物，對其進(jìn)行早期診斷。生物學(xué)標(biāo)志物存在于腦脊液、血液和尿液等標(biāo)本中，其中腦脊液直接和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外間隙相連，腦內(nèi)生物學(xué)的變化會在腦脊液中反映出來〔33〕。許多學(xué)者研究了腦脊液內(nèi)可能的標(biāo)志物，主要集中在Aβ、總Tau蛋白(T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(P-Tau)，檢測手段多為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蛋白組學(xué)技術(shù)〔34〕，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)來探索AD生物標(biāo)志物的研究還不多。

3 代謝組學(xué)在AD標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在臨床疾病中的應(yīng)用主要包括生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷〔35〕，但其最廣泛的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)與疾病診斷和治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物〔16〕。代謝組學(xué)從機(jī)體的動態(tài)代謝途徑尋找標(biāo)志物，將基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，檢測患者體內(nèi)所有的小分子代謝產(chǎn)物，從而使檢測更為容易。生物標(biāo)志物是疾病預(yù)防和診斷的基礎(chǔ)，這提示可以尋找更多的標(biāo)志物達(dá)到早期診斷和早期治療的目的。近年來，隨著代謝組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，一些學(xué)者嘗試運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)尋找能夠早期診斷AD的生物學(xué)標(biāo)志物(表2)，希望在AD發(fā)生的早期診斷出該病，加以及時(shí)的治療和干預(yù)。

表2 代謝組學(xué)分析技術(shù)在AD生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

4 展望

代謝組學(xué)尚處于初始階段，其分析技術(shù)還不完善，目前還未找到一致的、早期的、敏感的、特異性強(qiáng)的生物標(biāo)志物來預(yù)測和診斷AD。今后需進(jìn)一步發(fā)展代謝組學(xué)的各種分析技術(shù)，采用多種聯(lián)合技術(shù)，通過多個(gè)角度、多個(gè)層次，篩選并解析所有的譜峰，從整體上研究機(jī)體代謝的全部過程及代謝組分，尋找高靈敏和特異的AD生物標(biāo)志物。近年來，對AD患者尿液代謝組學(xué)的研究幾乎是一片空白，利用代謝組學(xué)新的研究方法，對尿液全組分進(jìn)行分析，尋找AD早期標(biāo)志物也是其發(fā)展方向。

1 Fiehn O，Kopka J，D¨ormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics〔J〕.Nat Biotechnol，2000;18(11):1157-61.

2 Craig A，Sidaway J，Holmes E，et al.Systems toxicology:integrated genomic，proteomic and metabonomie analysis of methapyrilene induced hepatotoxicity in the rat〔J〕.J Proteome Res，2006;5(7):1586-601.

3 Solanky KS，Bailey NJ，Beckwith-Hall BM，et al.Biofluid1H NMR-based metabonomic techniques in nutrition research-metabolic effects of dietary isoflavones in humans〔J〕.J Nutr Biochem，2005;16(4):236-44.

4 Lubbe A，Pomahacová B，Choi YH，et al.Analysis of metabolic variation and galanthamine content in Narcissus bulbs by1H NMR〔J〕.Phytochem Anal，2010;21(1):66-72.

5 Gao P，Shi C，Tian J，et al.Investigation on response of the metabolites in tricarboxylic acid cycle of Escherichi coli and Pseudomonas aeruginosa to antibiotic perturbation by capillary electrophoresis〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2007;44(1):180-7.

6 Robertson DG，Reily MD，Baker JD.Metabonomics in pharmaceutical discovery and development〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):526-39.

7 Wang DC，Sun CH，Liu LY，et al.Serum fatty acid profiles using GC-MS and multivariate statistical analysis:potential biomarkers of Alzheimer's disease〔J〕.Neurobiol Aging，2010〔Epub ahead of print〕.

8 King RD，Whelan KE，Jones FM，et al.Functional genomic hypothesis generation and experimentation by a robot scientist〔J〕.Nature，2004;427(6971):247-52.

9 Hansson O，Zetterberg H，Vanmechelen E，et al.Evaluation of plasma Abeta(40)and Abeta(42)as predictors of conversion to Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment〔J〕.Neurobiol Aging，2010;31(3):357-67.

10 Fiehn O.Metabolomics--the link between genotypes and phenotypes〔J〕.Plant Mol Biol，2002;48(1-2):155-71.

11 許國旺.代謝組學(xué)-方法與應(yīng)用〔M〕.北京:科學(xué)出版社，2008:8-14.

12 Price KE，Vandaveer SS，Lunte CE，et al.Tissue targeted metabonomics:metabolic profiling by mlcrodialysis sampling and microcoil NMR〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2005;38(5):904-9.

13 林魯霞，季 虹，榮海欽.代謝組學(xué)及其在糖尿病研究中的應(yīng)用〔J〕.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2010;30(z1):19-22.

14 Bruce SJ，Jonsson P，Antti H，et al.Evaluation of a protocol for metabolic profiling studies on human blood plasma by combined ultra-performance liquid chromatography/mass spectrometry:From extraction to data analysis〔J〕.Anal Biochem，2008;372(2):237-49.

15 Dettmer K，Aronov PA，Hammock BD.Mass spectrometry-based metabolomics〔J〕.Mass Spectrom Rev，2007;26(1):51-78.

16 許國旺，路 鑫，楊勝利.代謝組學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007;29(6):701-11.

17 Dumas ME，Maibaum EC，Teague C，et al.Assessment of analytical reproducibility of1H NMR spectroscopy based metabonomics for largescale epidemiological research:the INTERMAP study〔J〕.Anal Chem，2006;78(7):2199-208.

18 Kind T，Tolstikov V，F(xiàn)iehn O，et al.A comprehensive urinary metabolomic approach for identifying kidney cancer〔J〕.Anal Biochem，2007;363(2):185-95.

19 Yin P，Zhao X，Li Q，et al.Metabonomics Study of intestinal fistulas based on ultraperformance liquid chromatograpby coupled with Q-TOF mass spectrometry(UPLC/Q-TOF MS)〔J〕.J Proteome Res，2006;5(9):2135-43.

20 Hirayama A，Kami K，Sugimoto M，et al.Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry〔J〕.Cancer Res，2009;69(11):4918-25.

21 Katajamaa M，Oresic M.Data processing for mass spectrometry-based metabolomics〔J〕.J Chromatogr A，2007;1158(1-2):318-28.

22 Wagner S，Scholz K，Sieber M，et al.Tools in metabonomics:an integrated validation approach for LC-MS metabolic profiling of mercapturic acids in human urine〔J〕.Anal Chem，2007;79(7):2918-26.

23 Keun HC，Ebbels TM，Bollard ME，et al.Geometric trajectory analysis of metabolic responses to toxicity can define treatment specific profiles〔J〕.Chem Res Toxieol，2004;17(5):579-87.

24 Holmes E，Antti H.Chemometric contributions to the evolution of metabenomics:mathematical solutions to characterising and interpreting complex biological NMR spectra〔J〕.Analyst，2002;127(12):1549-57.

25 Lutz U，Lutz RW，Lutz WK.Metabolic profiling of glucuronides in human urine by LC-MS/MS and partial leastsquares discriminant analysis for classification and prediction of gender〔J〕.Anal Chem，2006;78(13):4564-71.

26 Trygg J，Holmes E，Lundstedt T.Chemometrics in metabonomics〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):469-79.

27 Wang C，Kong H，Guan Y，et al.Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers of type 2 diabetes mellitus based on high-performance liquid chromatography/eleetrospray mass spectrometry and multivariate statistical analysis〔J〕.Anal Chem，2005;77(13):4108-16.

28 Robertson DG，Reily MD，Baker JD.Metabonomics in pharmaceutical discovery and development〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):526-39.

29 Manzano S，González J，Marcos A，et al.Experimental models in Alzheimer's disease〔J〕.Neurologia，2009;24(4):255-62.

30 馬 英，曹云鵬.阿爾茨海默病的神經(jīng)免疫炎癥發(fā)病機(jī)制及其治療研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(21):3200-4.

31 牛豐南，孫宗正.阿爾茨海默病早期診斷的分子靶標(biāo)研究進(jìn)展〔J〕.國際神病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2009;36(1):86-90.

32 Simonsen AH，Hansson SF，Ruetschi U，et al.Amyloid beta1 ～40 quantification in CSF:comparison between chromatographic and immunochemical methods〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，2007;23(4):246-50.

33 姚 潔，王培昌.腦脊液生物學(xué)標(biāo)志物的檢測在阿爾茨海默病診斷中的應(yīng)用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007;27(16):1631-5.

34 Giannakis E，Hung LW，Camacaro KP，et al.Analysis of Abeta interactions using Protein Chip technology〔J〕.MethodsMol Biol，2008;494:71-86.

35 Schnackenberg LK，Beger RD.Monitoring the health to disease continuum with global metabolic profiling and systems biology〔J〕.Pharmacogenomics，2006;7(7):1077-86.

36 任進(jìn)民，黨志敏，李 風(fēng)，等.血漿中脫氫表雄酮硫酸酯檢測對阿爾茨海默病的臨床意義〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志，2010;18(3):161-3.

37 Du C，Ramaley C，McLean H，et al.High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry for the detection of amyloid beta peptide related with Alzheimer's disease〔J〕.J Biomol Tech，2005;16(4):356-63.

38 Li NJ，Liu WT，Li W，et al.Plasma metabolic proflling of Alzheimer's disease by liquid chromatography/mass spectrometry〔J〕.Clin Biochem，2010;43(12):992-7.

39 Greenberg N，Grassano A，Thambisetty M，et al.A proposed metabolic strategy for monitoring disease progression in Alzheimer's disease〔J〕.Electrophoresis，2009;30(7):1235-9.

40 羅柏寧，張 波，錢彩韻，等.磁共振氫質(zhì)子波譜對輕度阿爾茨海默病患者的評估作用〔J〕.中國臨床康復(fù)，2004;8(31):6874-5.

41 Salek RM，Xia J，Innes A，et al.A metabolomic study of the CRND8 transgenic mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Neurochem Int，2010;56(8):937-47.

42Tukiainen T，Tynkkynen T，M¨akinen VP，et al.A multi-metabolite analysis of serum by1H NMR spectroscopy:early systemic signs of Alzheimer's disease〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;375(3):356-61.

43 Kaddurah-Daouk R，Rozen S，Matson W，et al.Metabolomic changes in autopsy-confirmed Alzheimer's disease〔J〕.Alzheimers Dement，2011;7(3):309-17.