肺癌患者外周血白細胞端粒DNA相對長度檢測*

王 娜，周 舫，譚善娟，王丁丁

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州450001

△女，1976年4月生，碩士，講師，研究方向:職業(yè)性肺癌，E-mail:wefngqiao@zzu.edu.cn

目前，在世界范圍內(nèi)，肺癌居癌癥的發(fā)病率與死亡率之首［1］，且發(fā)病和死亡年齡有年輕化的趨向［2］，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。端粒是真核細胞中線性染色體末端的非編碼DNA 重復(fù)系列以及與之相連的端粒結(jié)合蛋白功能復(fù)合體，用以維護染色體的完整性和穩(wěn)定性，防止染色體降解和融合［3］，并能夠使分裂后的子代細胞準確獲得完整的遺傳信息。相關(guān)研究［4-5］表明端?？s短、端粒調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)失衡可能為肺癌發(fā)生的重要機制之一，端粒過短引起的染色體不穩(wěn)定在人類癌癥發(fā)展中的作用是端粒研究的一個熱點問題。作者應(yīng)用Real Time PCR 方法檢測了肺癌患者和健康人外周血白細胞端粒DNA 相對長度，以探討其與肺癌的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的肺癌患者54例，術(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療，均排除患有其他腫瘤，年齡36～74(59.6±9.5)歲，男37例，女17例;對照組為同期于該院體檢科進行體檢且結(jié)果顯示健康者，共77 人，年齡23～83(44.0±12.5)歲，男56 人，女21 人。

1.2 實驗標本的收集和保存 所有研究對象取空腹靜脈抗凝血2 mL，采用天根生化科技有限公司的人外周血DNA 提取試劑盒提取新鮮血液基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外周血白細胞端粒DNA 相對長度的測定分別選擇nRP 作為端粒DNA 的測定引物，選擇GAPDH 作內(nèi)參，運用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物。nRP 上游引物序列5’-CAGCAAGTGGGAAGGTG TAATCC-3’，下游引物序列5’-CCCATTCTATCAT CAACGGGTACAA-3’; GAPDH 上游引物序列5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’，下游引物序列5’-GAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’; 引 物 由 生 工生物工程(上海)有限公司設(shè)計并合成。采用SYBR Green ⅠReal Time PCR 技術(shù)檢測外周血白細胞端粒DNA 相對長度。PCR 反應(yīng)體系:2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，61℃退火和延伸1 min，共40 個循環(huán)。根據(jù)陰性對照調(diào)整閾值和基線以確定各個標本的Ct 值。每個樣本的端粒DNA 和內(nèi)參基因均設(shè)2 個平行樣并取均值作為該樣本端粒DNA 和內(nèi)參基因的Ct 值，每一輪PCR 反應(yīng)均設(shè)一個陰性對照。采用2－ΔΔCt法計算端粒相對長度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0 處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨立樣本的t 檢驗比較2組端粒DNA 相對長度的差異;以肺癌為因變量，以是否吸煙、年齡及端粒DNA 相對長度為自變量建立非條件logistic 回歸模型，進行多因素分析。其中吸煙者定義為每天吸煙1 支，持續(xù)半年以上(WHO)［6］;年齡以55 歲為分界點分為兩層;端粒相對長度根據(jù)對照組百分位數(shù)P33和P66從短到長分為3 層(T1:＜P33，T2:P33～，T3:≥P66)，以T3 層為參考水平，設(shè)置兩個啞變量。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查對象的基本資料 見表1。病例組與對照組相比，年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義，將年齡以55 歲為分界點分為兩層;2組性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 調(diào)查對象的基本資料例(%)

2.2 病例組與對照組外周血白細胞端粒DNA 相對長度比較 由于2組年齡分布不均衡，分別對病例組與對照組內(nèi)不同年齡組間端粒相對長度進行比較，結(jié)果見表2。根據(jù)表2結(jié)果，合并兩個年齡段的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，與對照組(3.86±1.46)相比，病例組外周血白細胞端粒DNA 相對長度(3.43±0.87)縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.093，P=0.038)。

2.3 Logistic 回歸分析結(jié)果 首先分別對年齡、吸煙、端粒DNA 相對長度進行單因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示年齡、吸煙及端粒DNA 相對長度均納入logistic 回歸方程當(dāng)中。進一步將3 者納入logistic 回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示，吸煙、年齡≥55 歲、T1 及T2 端粒DNA 相對長度較短均可能與肺癌發(fā)生危險度增高有關(guān)。見表3。

表2 各組不同年齡外周血白細胞端粒DNA 相對長度比較

表3 多因素logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

端粒在維護真核細胞染色體的完整性和穩(wěn)定性中起著重要作用。相關(guān)研究［4-5］表明，端粒穩(wěn)態(tài)失衡是肺癌發(fā)生的最主要機制之一，但有關(guān)端粒長度與肺癌關(guān)系的研究還存在很大的分歧。許多研究［7-9］報道端粒縮短在腫瘤的發(fā)病中起著重要的作用。端粒持續(xù)縮短可使染色體發(fā)生融合，從而導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定以及基因表達發(fā)生變化，使細胞永生化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。也有研究［10-11］發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞在增殖過程中隨著細胞的分裂，其端粒并不縮短，甚至延長，從而使細胞逃避衰老和死亡，獲得無限增殖的能力。

該研究結(jié)果顯示肺癌患者外周血白細胞端粒DNA 長度短于對照組;非條件logistic 回歸分析結(jié)果顯示，吸煙、年齡及端粒DNA 相對長度均為肺癌發(fā)生的危險因素，將吸煙和年齡調(diào)整后，發(fā)現(xiàn)人群患肺癌危險度隨著端粒DNA 相對長度的縮短而增加，表明端粒DNA 相對長度縮短可能與肺癌有關(guān)。

目前關(guān)于外周血端粒DNA 相對長度與肺癌關(guān)系的研究較少，結(jié)論存在著一定的矛盾。Wentzensen 等［12］的Meta 分析結(jié)果顯示，外周血白細胞端粒DNA 相對長度縮短可能與肺癌危險性增高有關(guān);Jang 等［13］用確診的肺癌患者242例和與之匹配的健康對照242例建立logistic 回歸模型，結(jié)果顯示短端粒與長端粒相比患癌危險性增高; 而Shen 等［11］做的一項關(guān)于外周血白細胞端粒長度與肺癌關(guān)系的前瞻性研究結(jié)果顯示，長端粒是肺癌發(fā)生的一個危險因素。相對于前瞻性研究來說，病例對照研究存在著較大的選擇偏倚，另外由于該研究的樣本量較小，可能對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

總之，該研究顯示端粒DNA 相對長度縮短可能與肺癌的發(fā)生有關(guān)。端粒長度與年齡、有害因素接觸、腫瘤類型及分期等多種因素有關(guān)，另外還受端粒酶及端粒結(jié)合蛋白的影響，在進行端粒與肺癌研究時應(yīng)充分考慮這些問題。今后需結(jié)合端粒在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制以及端粒酶的作用，擴大樣本量深入研究。

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