電針對SAMP8小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響

董衛(wèi)國,陳采益,林嵐,王豐,謝永財(cái),陳躍

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350108;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福州 350108)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD好發(fā)于60歲以后的老年人,隨著人口老齡化日益嚴(yán)重,AD發(fā)病率呈上升趨勢[1]。但其病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,目前沒有特效治療或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的藥物。針灸治療AD具有多途徑、多水平、多方式、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),而且療效可靠,副反應(yīng)少,越來越顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢[2-4]。大量的證據(jù)表明,能量代謝障礙及線粒體結(jié)構(gòu)及功能失調(diào)與 AD關(guān)系密切[5],而線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的變化是導(dǎo)致 AD能量代謝障礙的重要因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察電針對快速老化小鼠亞系(senescence accelerated mouse/prone 8,SAMP8)海馬神經(jīng)元線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的影響,從線粒體功能角度進(jìn)一步揭示針灸治療AD的作用機(jī)制,為臨床上針灸防治AD提供更充分的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8月齡SAMP8小鼠16只,8月齡抗快速老化小鼠亞系(senescence accelerated mouse/resistance1,SAMR1)8只,均為雄性,體重20～25 g,均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號scxk(京)2002-0001]。

1.2 主要儀器及試劑

毫針(華佗牌無菌針灸針,規(guī)格 0.25 mm×15 mm),G6805電針治療儀(上海醫(yī)療儀器廠),Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所),解剖顯微鏡(日本 Olympus公司),紫外分光光度計(jì)(Varian,美國),高效液相色譜儀系統(tǒng)(Waterz,美國)。提取及檢測線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體試劑,泛醌、氧化型 NADH、細(xì)胞色素C、抗霉素、EDTA、EGTA、DNA酶、Hepes、魚藤酮、牛血清白蛋白(BSA)等均購自美國Sigma公司。

1.3 動(dòng)物分組及治療

動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期。采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)的方法將SAMP8鼠隨機(jī)分為模型組、電針組,每組8只;SAMR1小鼠8只作為正常老化對照組。

電針組采用自制固定器固定小鼠,選擇百會、大椎、腎俞(雙側(cè))及太溪(雙側(cè))進(jìn)行電針治療。具體方法為,直刺進(jìn)針后,接G6805型電針治療儀,選連續(xù)波,頻率 2 Hz,電流強(qiáng)度以引起小鼠后肢肌肉輕微抖動(dòng)而不嘶叫為宜,每次20 min,每日1次, 10 d為1個(gè)療程,療程間隔1 d進(jìn)行下1個(gè)療程,共3個(gè)療程,計(jì)30 d。模型組和對照組不作治療,只進(jìn)行相同方式、相同時(shí)間和相同程度的抓取和小鼠固定器固定。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

采用 Morris水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,測試內(nèi)容包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)2部分。定位航行試驗(yàn)中,平臺位于第3象限,沒于水下1 cm,每天分上、下午兩個(gè)時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段每鼠訓(xùn)練4次,將小鼠分別從4個(gè)入水點(diǎn)(各象限池壁中點(diǎn))面向桶壁放入水中,記錄小鼠爬上平臺所需時(shí)間,即逃避潛伏期,如果90 s內(nèi)未找到平臺則將其引至平臺并在平臺停留 10 s,記錄逃避潛伏期為 90 s,連續(xù)進(jìn)行5 d。第6天撤離平臺,進(jìn)行空間探索試驗(yàn),將小鼠從平臺所在象限的對側(cè)象限放入池中,自由游泳60 s后結(jié)束試驗(yàn),記錄小鼠在原平臺象限停留的時(shí)間。

1.5 動(dòng)物處理

水迷宮檢測結(jié)束后,快速斷頭取腦,在冰浴上分離出完整海馬,存放于－80℃冰箱,用于檢測線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性。

1.6 小鼠海馬線粒體制備

整個(gè)制備過程均在0～4℃下進(jìn)行。將取出的海馬,稱重,按 9:1(W/V)加入勻漿緩沖液(甘露醇210 mmol/L,蔗糖 70 mmol/L,三羥甲基胺基甲烷8 mmol/L,EGTA 1 mmol/L,pH 7.5)。勻漿 15次,于1300 g離心10 min,吸出上清液,將沉淀再次勻漿,離心后合并2次上清液,于1300 ×g離心10 min,收集上清液,于17000 ×g離心15 min,沉淀用勻漿緩沖液清洗2次,重懸于勻漿緩沖液中;以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用Lowry法測定線粒體蛋白濃度,將其濃度調(diào)至200 μg/mL。

1.7 線粒體呼吸鏈酶活性測定

線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性檢測參照 Vyatlina的方法及結(jié)合我們以前的方法[6-7],用紫外分光光度法測定線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性,將 10～20 μg的線粒體蛋白加入到終體積為2 mL的緩沖液中,以蒸餾水作空白管,校正光密度到0點(diǎn),在30℃條件下,測定一定波長處 3 min內(nèi)光吸收值的變化。酶活性單位為nmol/min/mg protein。

1.7.1 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ活性測定

將線粒體與 10 mM Tris- HCl(pH8.0)緩沖液、80 μmol/L泛醌、1 mg/mL BSA、0.25 mM鐵氰化鉀、和0.4 μmol/L抗霉素A混合后,加入200 μM NADH啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測定340 nm處NADH吸收值的變化(NADH的消光系數(shù)ε=5.5 mmol/L－1cm－1)。

1.7.2 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ活性測定

將線粒體蛋白加入到復(fù)合物Ⅱ反應(yīng)緩沖液內(nèi),混勻后加入20 μM琥珀酸鹽啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測定600 nm處 2,6-二氯靛酚鈉鹽水合物(DCPIP)吸收值的變化(DCPIP 的消光系數(shù)ε=19.1 mmol/L－1cm－1)。反應(yīng)緩沖液含 50 mmol/L磷酸鹽、pH 7.4,50 μmol/L 2,6-二氯靛酚鈉鹽水合物、2 mmol/L鐵氰化鉀、2 μg/mL魚藤酮、2 μg/mL抗霉素A、25 μmol/L泛醌。

1.7.3 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ活性測定

將線粒體組分加入到線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ緩沖液內(nèi),混勻后加入 80 μM還原型泛醌(DBH2)(以二硫蘇糖醇還原)啟動(dòng)反應(yīng)。連續(xù)測定550 nm處細(xì)胞色素C吸收值的變化(細(xì)胞色素C的消光系數(shù)ε=19.0 mmol/L－1cm－1)。反應(yīng)緩沖液包括線粒體分離液、50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4、1 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、2 mmol/L鐵氰化鉀、50 μmol/L氧化型細(xì)胞色素C。

1.7.4 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅳ活性測定

將線粒體蛋白加入到復(fù)合體Ⅳ反應(yīng)緩沖液內(nèi),混勻后測定550 nm處細(xì)胞色素C吸光度變化3 min(細(xì)胞色素C的消光系數(shù)ε=19.0 mmol/L－1cm－1),即為細(xì)胞色素C氧化酶活性。緩沖液含線粒體分離液、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.0,25 mmol/L蔗糖,120 mmol/L氯化鉀,0.025%十二烷基β-D-麥芽糖苷,50 μmol/L還原型細(xì)胞色素 C。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定位航行試驗(yàn)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析,線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性采用單因素方差分析(one way ANOVA),如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則用 LSD(least significant difference)法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠逃避潛伏期比較

5 d的定位航行試驗(yàn)中,SAMR1對照組的逃避潛伏期明顯短于SAMP8模型組(P＜0.05或P＜0.01),說明同一種系的正常老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比快速老化小鼠強(qiáng)。與模型組比較,電針組平均逃避潛伏期縮短(P＜0.05或P＜0.01),并且第5天電針組平均逃避潛伏期接近對照組,提示電針能改善快速老化鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。詳見表1。

表1 各組小鼠平均逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 各組小鼠平均逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天對照組 8 50.3±8.82) 45.7±5.92) 37.9±9.62) 30.1±7.11) 24.2±5.21)模型組 8 71.4±10.4 65.8±8.6 58.1±7.7 45.2±6.9 37.2±9.5電針組 8 64.9±6.21) 55.3±9.12) 46.1±7.31) 38.2±6.52) 29.1±8.72)

2.2 各組小鼠在原平臺象限停留時(shí)間的比較

表2 各組小鼠在原平臺象限停留時(shí)間的比較 (±s,s)

表2 各組小鼠在原平臺象限停留時(shí)間的比較 (±s,s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 停留時(shí)間對照組 8 25.1±5.42)模型組 8 10.2±4.3電針組 8 17.3±6.21)

小鼠在原平臺象限游泳時(shí)間越長,反映小鼠對原平臺象限的記憶越好。模型組與 SAMR1對照組相比,時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)。電針組時(shí)間較模型組延長(P＜0.05),與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

2.3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性比較

對照組海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體(復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性均較模型組明顯增高(P＜0.01)。電針組海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體(復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性均較模型組明顯升高(P＜0.05)。電針組海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體(復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性比較(±s,nmol/min/mg protein)

表3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性比較(±s,nmol/min/mg protein)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 復(fù)合體Ⅰ 復(fù)合體Ⅱ 復(fù)合體Ⅲ 復(fù)合體Ⅳ對照組 8 15.15±2.132) 72.76±6.282) 49.92±3.912) 60.64±4.292)模型組 8 10.22±1.41 50.07±5.65 35.63±3.57 43.37±3.71電針組 8 12.76±2.311) 61.01±3.982) 44.56±4.531) 52.67±2.921)

3 討論

線粒體是具有雙層生物膜的細(xì)胞器,其主要功能是氧化代謝產(chǎn)物,并將產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為 ATP,為機(jī)體提供能量。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體是位于線粒體內(nèi)膜上與氧化磷酸化有關(guān)的蛋白質(zhì),主要包括復(fù)合體Ⅰ(NADH脫氫酶復(fù)合體),復(fù)合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶復(fù)合體),復(fù)合體Ⅲ(細(xì)胞色素還原酶復(fù)合體)及復(fù)合體Ⅳ(細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體)。線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性能直接或間接反映線粒體的呼吸功能狀況[8]。大量研究表明,AD的發(fā)生與線粒體密切相關(guān),AD患者腦組織活檢可見線粒體腫脹及數(shù)目減少[9]、DNA突變等形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,還觀察到線粒體膜電位降低,酶活性降低,ATP合成減少等功能異常。我們前期體外的研究結(jié)果也表明,β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid Protein,Aβ)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元 AD模型可見線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性降低,ATP含量減少[7]。這進(jìn)一步說明了線粒體及線粒體呼吸鏈與AD的密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與SAMP1對照組比較,SAMP8模型組海馬線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性降低。

SAMP8小鼠是由日本東京都大學(xué)竹田教授培育成功[10],SAMP8亞系的特征是中樞學(xué)習(xí)記憶功能隨增齡進(jìn)行性快速衰退[11]。研究表明,SAMP8腦內(nèi)具有多種與AD類似的病理變化[12],因此,SAMP8小鼠被認(rèn)為是一種相對較為完善的AD模型,已應(yīng)用于AD的研究。所以,本實(shí)驗(yàn)中我們選擇SAMP8作為AD動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

Morris水迷宮是檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的常用裝置。定位航行試驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)能力,而空間探索試驗(yàn)用來判斷其近期記憶能力。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),電針組潛伏期較模型組縮短,時(shí)間增加,表明電針可提高 AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,這與以前報(bào)道的結(jié)果一致。

已有學(xué)者研究報(bào)道,電針可減輕 SAMP8鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷及提高線粒體細(xì)胞色素 C氧化酶活力[13-15],表明電針對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能都有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)從線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體角度探討電針治療 AD的作用機(jī)制,其結(jié)果表明,電針能明顯提高線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性,進(jìn)一步證實(shí)了電針對線粒體功能的保護(hù)作用。由此,我們推測電針治療 AD的機(jī)制可能是提高線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性,從而改善線粒體功能及能量代謝。

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