微波消融聯(lián)合過繼免疫治療肝癌的臨床研究

周 佩，梁 萍，董寶瑋，于曉玲，于 杰，徐迎新

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院超聲影像科，武漢 430070;2.解放軍總醫(yī)院介入超聲科，北京 100853;3.解放軍總醫(yī)院普外研究所，北京 100853)

慢性乙肝合并肝癌患者存在多種免疫細胞功能缺陷［1］，多環(huán)節(jié)多途徑干預的免疫治療有利于提高患者總體免疫狀態(tài)、改善免疫缺陷。體外制備荷載腫瘤抗原的樹突狀細胞［2］和腫瘤抗原特異性和非特異性效應細胞過繼免疫治療肝癌［3-4］取得一定臨床療效。局部熱消融治療小肝癌的遠期療效與手術切除相當，已被公認為是繼手術和肝移植之后的根治性治療方法之一［5］。微波消融后，機體腫瘤負荷減輕、腫瘤對免疫系統(tǒng)的抑制大大解除，同時死亡和凋亡的腫瘤細胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露［6］，因而也是激發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫的最佳時機。

本研究觀察微波消融聯(lián)合過繼細胞免疫治療乙肝后肝硬化并原發(fā)性肝癌患者的臨床安全性，以及對外周血淋巴亞群比例的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。10例原發(fā)性肝癌患者接受微波消融聯(lián)合樹突狀細胞疫苗及效應細胞過繼免疫，納入聯(lián)合組?；颊呷虢M標準為:(1)肝內(nèi)病灶為單發(fā)結(jié)節(jié)，最大徑≤5 cm，或小于3個結(jié)節(jié)，最大徑≤3 cm;(2)無血管、膽管癌栓或肝外轉(zhuǎn)移;(3)肝功能Child分級A或B級;(4)有進針路徑，可行超聲引導下活檢及微波消融治療;(5)慢性乙型肝炎后肝硬化基礎病變;(6)肝癌病程≤3年。實驗室標準為:血紅蛋白＞100 g/L，白細胞計數(shù)＞2×109/L，血小板計數(shù) ＞75×109/L，血清肌酐＜110 μmol/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶＜3倍正常上限，血清膽紅素＜2.5倍正常上限，凝血酶原時間＜19 s，HCV和HIV陰性。排除標準包括:妊娠和哺乳期婦女，吸毒，精神異常，未控制的感染，全身皮質(zhì)激素治療，自身免疫性疾病，缺血性心臟病或心力衰竭，近6個月內(nèi)進行過化療或放療的患者。

同期符合相同納入和排出標準的24位經(jīng)皮微波治療的患者納入微波組，聯(lián)合組與微波組間性別、年齡、病程分布、肝功能Child分級、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑均無統(tǒng)計學差異(表1)。

1.2 微波消融方法

所有消融治療均在超聲引導下和靜脈麻醉下完成，所用麻醉劑為異丙酚和氯胺酮。微波設備為中國南京康友微波能應用研究所研制的KY-2000(2 450 MHz)及KY-2100(915 MHz)微波消融儀，配用微波天線為15 G硬質(zhì)裂隙水冷天線，最大輸出功率為100 W;隨機配備組織測溫系統(tǒng)，連接3根21 G組織測溫針(南京康友微波能應用研究所，中國)。

表1 聯(lián)合組與微波組患者及腫瘤基礎特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between combination group and PMWA group

微波治療方案設計為1次消融治療實現(xiàn)腫瘤完全滅活。根據(jù)腫瘤的大小、部位結(jié)合微波消融針熱場分布及操作者多年消融治療臨床經(jīng)驗，制定每位患者及每個腫瘤病灶的消融方案［7］。一般情況下，對于直徑＜1.7 cm的腫瘤，使用單根微波天線，對于直徑≥1.7 cm的腫瘤，使用兩根微波天線，根據(jù)腫瘤大小分次布針形成組合熱場。瘤邊緣區(qū)植入1根測溫針，監(jiān)測瘤邊緣溫度。對于腫瘤病灶鄰近胃腸、膽囊及肝內(nèi)Glission鞘一二級分支等重要器官和結(jié)構時，利用超聲引導，在腫瘤邊緣鄰近重要結(jié)構處的肝組織內(nèi)或腫瘤邊緣組織內(nèi)放置1～2根測溫針及1～2根21G的PTC針。治療中使用微波輸出功率為40～60周，通過PTC針在治療過程中緩慢注射1～5 ml無水酒精至鄰近重要結(jié)構處的腫瘤邊緣組織內(nèi)，并監(jiān)測測溫針所在鄰近重要結(jié)構部位的溫度，通過停止微波發(fā)射及/或改變輸出功率控制監(jiān)測部位溫度在45℃～60℃，維持10 min。治療過程中觀察超聲及瘤邊緣溫度上升情況，要求非鄰近危險部位瘤邊緣溫度達到60℃以上或54℃ 3 min以上，并且聲像圖顯示消融所致強回聲區(qū)完全覆蓋瘤區(qū)。微波組和聯(lián)合組患者均進行1～2次消融治療，使用微波針數(shù)為1～4針，兩組消融治療次數(shù)和治療針數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.3 DCs和效應細胞培養(yǎng)方法

免疫細胞的培養(yǎng)參照Romani等［8］報道的方法，在解放軍總醫(yī)院普外研究所GMP(Good Manufacturing Practice)實驗室進行。用淋巴細胞分離液(中科院血液研究所)采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。PBMCs懸浮于10 ml DC專用培養(yǎng)基STEM-34(Gibco，美國)，37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱貼壁3 h。吸出未貼壁細胞，貼壁細胞加入人重組粒巨噬細胞集落刺激因子(human recombinant granulocyte-macrophage colonystimulating factor，rh-GM-CSF)1000 U/ml(北京聯(lián)合藥業(yè))及人重組白細胞介素4(human recombinant interleukin 4，rh-IL-4)500 U/ml(北京聯(lián)合藥業(yè))，隔日半量換液，加入細胞因子，劑量同前。第7天收獲半量iDC細胞回輸，另半量iDC于第9天加入腫瘤抗原裂解物、BA 2.8萬粒/ml及細胞因子制備荷載腫瘤抗原的DC。未貼壁的PBMCs細胞用于制備CIK細胞，用淋巴細胞培養(yǎng)液KBM-551(TaKaRa，日本)重懸，加入 γ 干擾素(IFN-γ)1 000 U/ml，37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入CD3單抗(北京瑞得合通公司)2 μg/ml、CD28 單抗(北京瑞得合通公司)1 μg/ml、IL-2(北京瑞得合通公司)500 U/ml，37 ℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日添加新鮮培養(yǎng)基及IL-2，第12天收獲CIK細胞。在第二療程中，未貼壁的PBMCs細胞與第一療程中培養(yǎng)的荷載腫瘤抗原的DCs細胞共培養(yǎng)以制備CTL細胞(培養(yǎng)方法同CIK細胞)，第10天收獲。在第三療程中，在收獲和回輸?shù)那? d，CIK細胞與成熟DCs細胞以10∶1比例混合培養(yǎng)。

1.4 免疫細胞回輸前表型分析

免疫細胞回輸前，利用單抗與表面分子直接結(jié)合法，采用四色流式細胞儀 FACSCalibur(BD Biosciences)及Cell QuestPro軟件對免疫細胞特異性表面標志分子進行表型分析。各流式檢測管中加入細胞樣本(1 ×106)，離心 1 500 r/min，5 min，棄上清;加入1 ml的D-hanks'液洗滌，離心1 500 r/min，5 min，棄上清;加入抗體標記樣本細胞(CD4/8/3抗體各20 μl及 CD56 抗體5 μl標記效應細胞，CD80/86/83及 HLA-DR 抗體各 20 μl標記 DC)，避光40 min;加入2 ml的D-hanks'液洗滌，離心1500 r/min，5 min，棄上清，加入500 μl鞘液上機檢測分析。

1.5 免疫治療方案

免疫治療三個療程分別開始于微波治療日、微波治療后11 d和第100天，免疫細胞從患者45 ml外周血中分離和誘導培養(yǎng)。第一療程中，微波治療前1周，抽取患者外周血用于分離誘導培養(yǎng)DC及CIK細胞;微波治療前活檢，2條組織送病理檢查，3條組織用于凍融法制備自身腫瘤抗原;微波消融后2 h，行超聲造影評價消融療效排除殘存高增強結(jié)節(jié);在超聲造影引導下將21 G穿刺針引導至消融區(qū)與充血帶交界區(qū)后緣，局部注射半量培養(yǎng)7 d的iDC(＜2 cm結(jié)節(jié)注射4 ml，≥2 cm結(jié)節(jié)注射8 ml)，將穿刺針退至消融區(qū)與充血帶交界區(qū)前緣，注射剩余半量。微波治療后第5天，經(jīng)靜脈回輸CIK。第二療程中，微波治療后次日，抽取患者外周血用于分離培養(yǎng)制備負載腫瘤抗原的成熟DC和CTL，于微波消融后第11天回輸。成熟DCs懸浮于1 ml生理鹽水中在超聲引導下回輸?shù)诫p側(cè)腹股溝淋巴結(jié)(每側(cè)0.5 ml)。CTL細胞懸浮于20 ml生理鹽水中，于微波消融后第11天在超聲造影引導下于肝內(nèi)消融區(qū)與充血帶交界區(qū)局部回輸4 ml或8 ml(方法同iDC回輸)，剩余量在超聲引導下回輸?shù)接疑细垢骨粌?nèi)。第三療程中，成熟DC于培養(yǎng)后第10天回輸至腹股溝淋巴結(jié)內(nèi);DC-CIK于培養(yǎng)后第10天回輸?shù)接疑细垢骨粌?nèi)及第12天經(jīng)靜脈回輸。

1.6 外周血淋巴細胞亞群分析

患者治療前后外周血淋巴細胞表型分析用流式細胞儀進行檢測。血樣以EDTA抗凝，各檢測管中加入相應抗體(CD3-PerCP，CD4-FITC，CD8-FITC，CD 25 PE，CD 28 PE，CD56 PE，Mouse IgG1-FITC，Mouse IgG1-PE，Mouse IgG2a-PE，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，BDIS，USA)，混勻，室溫暗處反應15 min;加入2 ml FACS Lysing Solution(BDIS，USA)，混勻，室溫暗處放置10 min;3 000 r/min，離心 5 min，棄上清;洗滌，加入 300 μl 1% 多聚甲醛;2℃～8℃暗處保存，24 h內(nèi)用FACS-Calibur(Becton Dickinson，USA)檢測分析。

1.7 病理診斷、臨床觀察及隨訪

每位患者治療至少2種增強影像檢查考慮肝癌診斷，所有初發(fā)的肝癌患者微波治療前均行超聲引導下活檢，每位患者均有明確病理診斷。

微波消融治療前、消融后1、3個月及以后每3個月、1年后每6個月行實驗室檢查及US、增強CT或增強MRI檢查。實驗室檢查隨訪指標包括血常規(guī)、腫瘤標記物、肝腎功能。消融治療前1周及治療后1、3、6個月進行外周血淋巴細胞亞群百分比檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)使用CHISS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示。計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析或秩和檢驗;計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 微波消融聯(lián)合過繼細胞免疫治療的安全性

聯(lián)合治療組10例患者54次細胞回輸治療未出現(xiàn)Ⅲ或Ⅳ級嚴重不良反應，治療后主要的不良反應為發(fā)熱及輕微乏力，15(27.78%)次細胞回輸后無任何不良反應，39(72.22%)次細胞回輸后出現(xiàn)發(fā)熱，21次為低熱，9次出現(xiàn)38℃～39℃之間中等發(fā)熱，僅9次為39℃以上高熱。經(jīng)對癥處理，2～7 d后體溫降至正常，乏力癥狀也消失，不同細胞回輸后發(fā)熱程度及持續(xù)時間均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。實驗室檢查動態(tài)觀察6個月，臨床觀察12個月以上，未發(fā)現(xiàn)有明顯肝腎心肺、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用，亦無明顯自身免疫疾病臨床表現(xiàn)。

2.2 患者外周血淋巴細胞亞群百分比的變化

治療前聯(lián)合組與微波組外周血各淋巴細胞亞群百分比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);微波組治療后1、3、6個月時外周血各淋巴細胞亞群百分比與治療前相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，聯(lián)合組患者治療前后外周血 CD3+、CD3+CD56+及 CD3-CD56+細胞亞群百分比無明顯變化，而 CD4+、CD8+、CD4+CD25high、CD8+CD28+、CD8+CD28－細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值有較大變化。

治療后1個月，聯(lián)合組患者外周血CD4+細胞百分比降低并顯著低于微波組(P＜0.01)、CD8+細胞百分比升高并顯著高于微波組(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值降低并顯著低于微波組(P＜0.01)。聯(lián)合組患者外周血CD4+CD25highTreg細胞亞群較治療前顯著降低(P＜0.05)，并顯著低于微波組(P＜0.05)。聯(lián)合組原初及早期效應細胞亞群CD8+CD28+細胞百分比較治療前升高，而微波組較治療前降低，(P＜0.01)，聯(lián)合組中晚期記憶及效應細胞亞群CD8+CD28－細胞百分比較治療前顯著升高(P＜0.05)。

經(jīng)過兩個療程免疫治療后，第3個月時，聯(lián)合組患者外周血CD4+細胞百分比低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05)、CD8+細胞百分比降低僅略高于治療前，與微波組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但CD4+/CD8+比值仍低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05，圖2)。聯(lián)合組患者外周血CD4+CD25+細胞亞群百分比仍顯著低于治療前(P＜0.05)，但 CD4+CD25highTreg細胞亞群百分比與微波組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。聯(lián)合組CD8+CD28+細胞亞群百分比雖已降至治療前水平但仍顯著高于微波組(P＜0.05)，且記憶及效應細胞亞群CD8+CD28－細胞百分比仍顯著高于治療前(P＜0.05)，見表2。

表2 聯(lián)合組與微波組治療前后外周血淋巴細胞亞群比例的比較Tab.2 Comparison of the percentage of peripheral lymphocytes between combination group and PMWA group before and after treatment

經(jīng)過第三療程免疫治療，治療后6個月時，聯(lián)合組患者外周血淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值依然低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05);效應T細胞亞群CD8+CD28+百分比再次升高，顯著高于微波組(P＜0.01)，而 CD8+CD28－、CD4+CD25+及CD4+CD25highTreg細胞亞群與治療前比較以及與微波組比較均無顯著差異。

3 討 論

目前，治療肝癌的有效方法有手術切除、局部消融和經(jīng)肝動脈栓塞等，均能極大地減少腫瘤負荷，取得顯著的階段性臨床療效。然而，腫瘤常常在治療后1年內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)。既往的研究［9］表明，微波治療刺激局部免疫反應，但持續(xù)時間較短，提示微波治療后有必要進行免疫治療，進一步鞏固和擴大消融治療后減滅瘤負荷的成果，達到降低和延緩腫瘤復發(fā)的目的。根據(jù)0級動力學原則，一定的免疫活性細胞只能殺滅一定數(shù)量的腫瘤細胞，較少數(shù)量的腫瘤細胞能被免疫系統(tǒng)消滅，而較多的腫瘤負荷則難以抗衡。肝癌病灶微波消融后體內(nèi)大部分腫瘤細胞死亡，機體腫瘤負荷已階段性降至低谷，但病灶局部、肝內(nèi)或肝外以及血循環(huán)內(nèi)可能仍然存在少量的腫瘤細胞或微小病灶，消融后早期應為進行免疫治療的最佳時機。

肝癌患者多有慢性肝炎感染和肝硬化背景，機體免疫狀態(tài)復雜，肝癌消融術后即刻聯(lián)合免疫治療的治療方案尚未見報導，臨床治療安全性是首先必須在治療過程中觀察和證實的。本臨床初步研究結(jié)果表明微波消融后聯(lián)合樹突狀細胞疫苗及效應細胞過繼轉(zhuǎn)移治療是安全的，沒有發(fā)生任何Ⅱ級以上不良反應。主要不良反應為發(fā)熱及輕微乏力，持續(xù)時間短，僅需對癥處理，患者完全可以耐受并不影響日?；顒?。且不同細胞回輸后發(fā)熱的程度及持續(xù)時間均無明顯差異，特別是微波聯(lián)合消融區(qū)周邊注射iDC治療后與其他免疫細胞回輸治療后發(fā)熱程度及持續(xù)時間無明顯差異，表明本臨床研究設計的免疫治療方案是安全可行的。免疫治療后隨訪12個月，患者的肝腎功能、凝血功能及血常規(guī)多個指標均與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義，表明免疫治療對患者肝腎功能及骨髓造血功能均無明顯影響;臨床觀察未發(fā)現(xiàn)對肺、心及神經(jīng)系統(tǒng)有影響，亦未發(fā)現(xiàn)自身免疫疾病發(fā)生，表明本臨床研究設計的微波聯(lián)合免疫治療方案是安全可行的。

消融治療后，不僅機體腫瘤負荷減輕、腫瘤對免疫系統(tǒng)的抑制大大解除，同時死亡的腫瘤細胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露，因而也是激發(fā)機體特異性抗腫瘤免疫的最佳時機。本研究在微波治療后11 d內(nèi)，設計了2個療程，綜合應用多種免疫活性細胞通過多個途徑進行免疫治療，利用超聲造影在消融術后早期及時、準確評價療效以及精確定位消融區(qū)與充血帶交界區(qū)的優(yōu)勢，將細胞回輸?shù)较趨^(qū)與充血帶交界區(qū)，將效應細胞或荷載腫瘤抗原的成熟DC細胞在超聲引導下回輸?shù)礁骨粌?nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)。利用iDC遷移及吞噬能力強的特點，將iDC回輸?shù)礁伟┎≡钕趨^(qū)局部，能高效地提呈腫瘤抗原，激發(fā)特異性抗腫瘤免疫，特別是能在消融區(qū)局部激活免疫細胞，從而改善了腫瘤病灶的局部微環(huán)境，有利于殺滅殘癌。腫瘤抗原致敏的成熟DC細胞，具有可直接向淋巴細胞遞呈腫瘤抗原的功能且遷徙能力較差，因而直接回輸?shù)搅馨拖到y(tǒng)內(nèi)能更有利于發(fā)揮其激活淋巴細胞的作用。效應細胞是腫瘤細胞的直接攻擊者，活化淋巴細胞還可釋放細胞因子，將活化淋巴細胞回輸?shù)侥[瘤局部有利于改善局部免疫微環(huán)境。因而，微波消融后多種免疫細胞綜合過繼治療有利于從多環(huán)節(jié)上改善機體免疫。

細胞免疫在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。人類血循環(huán)中的T細胞是一群異質(zhì)細胞群，由許多表型和功能不同的亞型組成。共刺激分子CD28的表達將 T淋巴細胞分為 CD28+和 CD28－兩亞群。CD28+是表達在原初未經(jīng)抗原活化T細胞的表面分子。CD28－T細胞為CD28+T細胞與抗原提呈細胞表面的B 7.1(CD80)和 B 7.2(CD86)配體結(jié)合后，CD28+分子表達下調(diào)而成為CD28－表型的活化的能識別抗原的效應細胞［10］。CD4+細胞是輔助性T細胞(T helper，Th)，受抗原刺激后可誘導分化為Th1和Th2細胞，Th1細胞有利于誘導正向抗腫瘤免疫反應，而 Th2細胞抑制抗腫瘤免疫反應。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是潛在的免疫反應的抑制者，是一群異質(zhì)性細胞群。既往研究表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞損害CD8+CTL細胞的功能，并與肝癌的侵犯轉(zhuǎn)移相關［11-12］。以往以CD4+CD25+表型細胞代表調(diào)節(jié)性T細胞，但其中難以區(qū)分調(diào)節(jié)性和活化的CD4+T細胞。新近研究［15］表明，Treg主要存在于CD4+細胞中高表達CD25的細胞亞群(CD4+CD25high)［13］。因而CD8+CD28+、CD8+CD28－及CD4+CD25high淋巴細胞亞群百分比的動態(tài)變化能反應機體免疫狀態(tài)的改變。

研究表明，微波聯(lián)合免疫治療后明顯改善了患者外周血淋巴細胞亞群的百分比和免疫狀態(tài)。聯(lián)合免疫治療后輔助T細胞亞群CD4+百分比降低、效應細胞亞群CD8+百分比增高及CD4+/CD8+比值降低均與微波組差異有統(tǒng)計學意義，表明免疫治療刺激了CD8+T細胞增殖，明顯改變了患者外周血細胞百分比狀態(tài)，且影響一直持續(xù)到治療后6個月;更重要的是，聯(lián)合免疫治療后外周血原初效應細胞亞群CD8+CD28+百分比升高，顯著高于微波組，并且一直持續(xù)到治療后6個月。治療后1、3個月，聯(lián)合組CD8+CD28－細胞亞群百分比亦較治療前顯著升高，表明免疫治療不僅刺激了CD8+T細胞增殖，擴大了效應細胞池，而且誘導了腫瘤抗原特異性效應細胞，激發(fā)了機體抗腫瘤免疫機能。聯(lián)合免疫治療后1個月CD4+CD25highTreg調(diào)節(jié)細胞亞群較治療前顯著降低，并顯著低于微波組，表明免疫治療明顯改善了患者的免疫抑制狀態(tài)。總之，治療后患者抑制免疫反應的調(diào)節(jié)性T細胞百分比降低，活化效應細胞百分比升高，表明患者機體免疫狀態(tài)和免疫微環(huán)境得到了正向調(diào)節(jié)和改善，抗腫瘤免疫機能得到激發(fā)和提高。

同時也需要注意到，治療后3個月時CD8+CD28+亞群百分比較治療后1個月時降低，經(jīng)過第三療程治療后再次升高。治療后6個月時，抗原特異性效應細胞CD8+CD28－亞群百分比較治療后1和3個月時降低。治療后3個月時CD4+CD25highT淋巴細胞亞群百分比較1個月時升高，雖仍低于治療前但與微波組已無顯著差異。經(jīng)過第三個療程的免疫治療后，6個月時CD4+CD25highT淋巴細胞亞群百分比較3個月時降低但仍高于治療后1個月，并且與微波組無顯著差異。正向和反向調(diào)節(jié)免疫的兩個淋巴細胞亞群百分比變化趨勢表明，聯(lián)合組患者前2個療程免疫治療力度大，效果較好，持續(xù)時間較長，而第3個療程免疫治療后對患者外周血細胞亞群比例和免疫功能的改善效果已減弱，表明本過繼免疫治療方案改善了機體免疫狀態(tài)，但持續(xù)時間有限。

本研究表明微波消融術后早期聯(lián)合樹突狀細胞和效應細胞綜合過繼免疫治療肝癌是安全的，改善了患者外周血淋巴細胞比例和機體免疫狀態(tài)，其對臨床療效的影響尚需大樣本隨機試驗及長時間隨訪觀察。

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