檳榔江水牛STAT5A基因多態(tài)性及MspI PCR－RFLP遺傳標記的建立

季 敏，余長林，余選富，劉定江，劉學洪，史憲偉＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南 昆明650201；2.云南省騰沖縣畜牧工作站，云南 騰沖679100）

STAT（Signal transducer and activator of transcription，信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子）是一族蛋白質(zhì)，包括STAT1，2，3，4，5A，5B，6共7個成員，它們主要介導若干激素和細胞因子的活動［1］。STAT5A基因位于牛的19號染色體上［2］，作為乳腺調(diào)控因子主要調(diào)控靶基因中催乳素和生長激素的活動［3，4］，Ball與Lee的研究已經(jīng)證明乳蛋白基因的表達受催乳素與腎上腺皮質(zhì)激素的協(xié)同調(diào)控［5，6］，Bauman等證明注射生長激素對奶牛的產(chǎn)奶量有提高作用［7］。因此，STAT5A基因可以作為一個與泌乳有關(guān)的候選數(shù)量性狀位點。國外對牛STAT5A基因的研究報道較多，而在水牛上還未見報道。Flisikowski等對不同牛種進行了STAT5A基因外顯子7單核苷酸多態(tài)性的研究，結(jié)果在STAT5A基因外顯子7檢測到1個SSCP位點，6種基因型［8］。Selvaggi運用PCR－RFLP（AvaI酶切）技術(shù)在意大利布朗牛STAT5A基因外顯子7第6853位置發(fā)現(xiàn)了一個C／T堿基替換，且CC和CT基因型與產(chǎn)奶量，乳蛋白含量和乳脂含量有非常明顯的相關(guān)性。CC基因型比CT基因型產(chǎn)奶量高，CC基因型乳蛋白質(zhì)含量也高于CT基因型，但乳脂含量沒有明顯的差異［9］。Brym在荷斯坦和新澤西州牛的STAT5A基因內(nèi)含子9第9501位置處發(fā)現(xiàn)一個新的SNP（A／G）。對荷斯坦牛來說，不同的基因型與泌乳性狀之間沒有明顯的相關(guān)性，但在新澤西牛中，不同基因型與頭胎次和二胎次泌乳量，乳蛋白率和乳脂率之間存在著明顯的相關(guān)性，GG型牛有高產(chǎn)奶量，而AA和AG型牛蛋白質(zhì)產(chǎn)量高［10］。鮑斌等在中國荷斯坦牛STAT5A基因內(nèi)含子9第9501位置也發(fā)現(xiàn)了A／G突變［11］。

檳榔江水牛是迄今為止在我國發(fā)現(xiàn)的惟一的河流型水牛，主要分布在云南省騰沖縣檳榔江流域，已有500余年的飼養(yǎng)歷史［12］。2008年7月11日通過了國家畜禽遺傳資源委員會鑒定，其乳用性能較好，是發(fā)展中國水牛乳業(yè)和云南特色畜牧業(yè)的寶貴種質(zhì)資源［13］。所以對檳榔江水牛的研究有著重要的意義。近年來隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的PCR－RFLP和以DNA測序為核心的分子標記技術(shù)對特定基因的多態(tài)性研究已經(jīng)很成熟，本文利用PCR－RFLP和測序技術(shù)研究了STAT5A基因多態(tài)性，為今后探討STAT5A基因?qū)壚平Ｃ谌樾誀畹挠绊懸约傲挤N水牛的保種選育提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

66頭檳榔江水牛來自云南省騰沖縣巴福樂檳榔江水牛良種繁育公司。采其耳朵組織，浸泡于無水酒精中于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用傳統(tǒng)的苯酚／氯仿抽提法。TE溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 根據(jù)NCBI上提供的牛（Bos taurus）的STAT5A基因序列（Gene bank登錄號：NW＿003104496.1），利用primer3在線設計3對引物P1，P2，P3，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小見表1，引物擴增區(qū)域詳見圖1。

表1 引物P1，P2，P3的DNA序列，擴增區(qū)域和擴增產(chǎn)物長度

圖1 STAT5A基因結(jié)構(gòu)和引物位置分布圖

1.2.3 PCR體系與條件 PCR反應體系為50 μL：10×Buffer 5μL（含 Mg2＋），上、下游引物（10 μmmol／L）各1.5μL ，dNTPs（2.0mmol／L）1μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，DNA 4μL （約50ng），dH2O補至50μL。擴增程序：94℃預變性2min→10個循環(huán)（94℃變性45s→65℃，退火45s，每個循環(huán)遞減1℃→72℃延伸2min）→30個循環(huán)（94℃變性45s→56℃，退火45s，72℃延伸2min）→72℃后延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（溴化乙啶染色），電泳檢測。

1.2.4 測序 PCR擴增產(chǎn)物送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行雙向測序，測序采用ABI3730xl測序儀及配套的BigDye Terminator試劑盒。

1.2.5 PCR－RFLP 酶切反應體系為20μL：10×酶解緩沖液2μL，MspI（20I／μL）0.5μL，4μL PCR產(chǎn)物，加水至20μL，37℃水浴4h以上。用1.0%的瓊脂糖凝膠（溴化乙啶染色）電泳檢測。

1.2.6 序列分析及數(shù)據(jù)分析 應用DNAstar軟件包對測序結(jié)果進行比對分析。等位基因頻率、基因型頻率及Hardy－Weinberg遺傳平衡分析采用excel及SPSS 16.0進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔江水牛STAT5A基因PCR擴增結(jié)果

擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶清晰，產(chǎn)物片段大小與預期片段大小相符，特異性良好，可用于測序和酶切反應。電泳檢測結(jié)果見圖2和圖3。

2.2 測序結(jié)果及SNP分析

為了檢測檳榔江水牛STAT5A基因多態(tài)性，我們選擇了8個水牛個體進行正反雙向測序。通過對所有測序結(jié)果進行分析，共發(fā)現(xiàn)38個變異位點。其中引物P1擴增產(chǎn)物片段發(fā)現(xiàn)24個變異位點，引物P2擴增片段發(fā)現(xiàn)11個變異位點，引物P3擴增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)3個變異位點。所檢測到的所有變異位點均為單核苷酸變異（SNP），未發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失。其中外顯子8產(chǎn)生2處C924T，C975T突變，氨基酸分析表明，沒有導致308位氨基酸（脯氨酸）和325位氨基酸（絲氨酸）的變化；外顯子13產(chǎn)生2處G1482A，C1548T突變，沒有導致494位氨基酸（脯氨酸）和516位氨基酸（丙氨酸）的變化。檢測到的 所有SNP位點信息見表2。

圖2 引物P1PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 引物P2，P3PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 檳榔江水牛STAT5A基因SNP位點

2.3 PCR－RFLP結(jié)果

通過對引物P3擴增片段測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)含子15中一個C→T堿基替換產(chǎn)生了一個MspI限制性內(nèi)切酶位點，因此我們建立了MspI酶切位點的PCR－RFLP分子標記技術(shù)。該變異位點序列見圖4。用MspI限制性內(nèi)切酶對全部66個樣品進行酶切反應，得到的結(jié)果見圖5與表3。

圖4 檳榔江水牛STAT5A基因內(nèi)含子15的一個變異位點序列

圖5 引物P3擴增產(chǎn)物MspI酶切結(jié)果

表3 引物P3擴增產(chǎn)物PCR－RFLP檢測到的基因型頻率和等位基因頻率

檳榔江水牛MspI酶切位點由C和G兩個等位基因控制，酶切得到三種基因型，分別為CC，CG，GG?；蛐蜑镃C的片段被切成452bp和330bp兩條帶；雜合子CG為782bp，452bp和330bp三條帶；基因型為GG的片段只有一條782bp的條帶，未被切開。通過計算發(fā)現(xiàn)，CG為優(yōu)勢基因型，C為優(yōu)勢基因，等位基因C的頻率明顯高于等位基因G的頻率。經(jīng)χ2適合性檢驗，檳榔江水牛MspI酶切位點的χ2值為0.546，差異水平不顯著（P＞0.05），說明檳榔江水牛在MspI酶切位點上處于Hardy－Weinberg平衡。

2.4 基因頻率

對全部66個樣品用引物P1進行擴增并全部測序。通過對測序結(jié)果進行分析，共發(fā)現(xiàn)24個變異位點。各變異位點的等位基因頻率和基因型頻率見表4。

表4 引物P1擴增產(chǎn)物變異位點的等位基因頻率和基因型頻率

經(jīng)χ2適合性檢驗可得，全部24個變異位點中有21個位點差異不顯著，達到了Hardy－Weinberg平衡，有3個位點差異顯著，偏離Hardy－Weinberg平衡。

3 討論

在奶牛輔助標記選擇中提出了很多基因作為潛在的候選基因，STAT5A因為在催乳素和生長激素的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用而成為候選基因之一。在STAT5A基因中發(fā)現(xiàn)的核苷酸多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性與奶牛的泌乳性狀如產(chǎn)奶量，乳蛋白率和乳脂率有關(guān)聯(lián)。在牛STAT5A基因中已檢測到許多核苷酸多態(tài)性。Khatib等人在奶牛STAT5A基因外顯子8中發(fā)現(xiàn)一個SNP位點是G／C堿基替換［14］；McCracken 等人［15］在STAT5A基因內(nèi)含子12中發(fā)現(xiàn)了不同長度的TG重復；Flisikowski等人在牛內(nèi)含子15中發(fā)現(xiàn)CCT缺失，而在外顯子16中發(fā)現(xiàn)一個T／C突變，該突變導致686位的氨基酸由纈氨酸變?yōu)楸彼幔?6，17］；Flisikowski等人還在STAT5A基因的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)2個SNP位點，分別是－247A／G替換 和－226G／A替換，經(jīng)PCR－RFLP分析，這兩個變異位點存在SgrAI或者Sma I酶切位點［18］。

本研究在檳榔江水牛STAT5A基因中共發(fā)現(xiàn)38個SNP變異位點，沒有發(fā)現(xiàn)堿基插入或缺失變異。其中內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)34個變異位點，外顯子中有4個。騰沖縣位于云南省保山市西南部，西部與緬甸毗鄰，歷史上曾是古西南絲綢之路的要沖，騰沖縣的地理位置決定了檳榔江水牛與亞洲其他水牛種群之間的交流十分頻繁，特別是與國內(nèi)外沼澤型水牛雜交繁殖，導致檳榔江水牛的遺傳變異十分豐富。其中外顯子8中的兩個SNP位點都是C／T堿基替換，外顯子13中有2個SNP位點，分別是G／A變異和C／T變異。外顯子中的4個變異都是同義突變，沒有引起氨基酸的變化。檳榔江水牛內(nèi)含子15的1個C／T堿基的替換產(chǎn)生了一個MspI酶切位點，經(jīng)χ2檢驗該酶切位點達到了Hardy－Weinberg平衡，這說明在此位點的基因型頻率和基因頻率將穩(wěn)定遺傳，處于遺傳平衡狀態(tài)。酶切結(jié)果顯示，該酶切位點CG基因型頻率（0.485）高于CC和GG基因型頻率（0.424，0.091），說明在此位點雜合子是優(yōu)勢基因型。在特定的條件下雜合子個體可能比正常純合子個體更有利于生存和繁殖后代。因此在大規(guī)模群體檢測中此位點可以作為一個快速簡便的遺傳標記。對引物P1擴增區(qū)域進行群體遺傳學分析表明，全部24個變異位點中有21個處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)，只有3個位點偏離Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。偏離 Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)的SNP是由于樣本數(shù)量有限還是與選種選育引起的遺傳漂變有關(guān)有待于進一步研究。

［1］Darnell J E，Kerr I M，Stark G R.JAK－STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extra－cellular signaling proteins［J］.Science，1994，264（5164）：1415－1421.

［2］Goldammer T，Meyer L，Seyfert HM，etal.STAT5Aencoding gene maps to chromosome 19in cattle and goat and chromosome 11in sheep［J］.Mammal Genome，1997，8：705－706.

［3］Wakao H，Gouilleux F，Groener B.Mammary gland factor（MGF）is a novel member of the cytokine－regulated transcription factor gene family and confers the prolactin response［J］.EMBO，13（9）：2182－2191.

［4］Argetsinger LS，Carter－Su C.Growth hormone signalling mechanisms：involvement of the tyrosine kinase JAK2［J］.Hormone Research，1996，4522－4524.

［5］Ball R K，F(xiàn)riis R R，Schoenenberger C A，etal.Prolactin regulation ofβ－casein gene expression and of a cytosolic 120KD protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line［J］.EMBO，1988，7：2089－2095.

［6］Lee C S，Kim K，Yu DY，etal.Pretreatment with glucocorticoid is essential for lactogenic induction of the bovine beta－casein／CAT expression in HC11cells［J］.Endocrine Research，1998，24：65－77.

［7］Bauman D E，RG Vernon.Effects of exogenous bovine somatotropin on lactation［J］.Annual review of nutrition，1993，13：437－461.

［8］Flisikowski K，Zwierzchowski L.Single strand conformation polymorphism with exon 7of the bovineSTAT5Agene［J］.Animal Science Papers and Reports，2002，2（20）：133－137.

［9］Maria Selvaggi，Cataldo Dario，Giovanni Normanno，etal.Genetic polymorphism ofSTAT5Aprotein：relationships with production traits and milk composition in Italian Brown cattle［J］.Journal of Dairy Research，2009，76（4）：441－445.

［10］Pawe Brym，Stanisaw Kamiski，Anna Ruoeae.New SSCP polymorphism within bovineSTAT5Agene and its associations with milk performance traits in Black－and－White and Jersey cattle［J］.Appl Genet.，2004，45（4）：445－452.

［11］鮑 斌，房興堂，陳 宏，等.中國荷斯坦牛STAT5A基因遺傳多態(tài)性與泌乳性狀的相關(guān)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（6）：1872－1878.

［12］章純熙，苗永旺，李大林.我國首例本土河流型水?！獧壚平５姆N質(zhì)特征［J］.家畜生態(tài)學報，2011，32（16）：39－45.

［13］王長青.我國水牛奶業(yè)開發(fā)前景及對策［J］.中國畜牧雜志，2004，40（4）：37－39.

［14］Khatib H，Monson R L，Schutzkus V，etal.Mutations in theSTAT5Agene are associated with embryonic survival and milk composition in cattle［J］.Journal of Dairy Science，2008，91：784－793.

［15］McCracken J Y，Molenaar A J，Snell R J，etal.A polymorphic TG repeat present within the bovineSTAT5Agene［J］.Animal Genetics，1997，28，453－464.

［16］Flisikowski K，Szymanowska M，Zwierzchowski L.The DNA－binding capacity of genetic variants of the bovineSTAT5Atranscription factor［J］.Celluar ＆ Molecular Biology Letters，2003，8：831－840.

［17］Flisikowski K，Zwierzchowski L.Polymerase chain reactionheteroduplex （PCR－HD）polymorphism within the bovineSTAT5Agene［J］.Appl Genet，2003，44：185－189.

［18］Flisikowski K，Hiendleder S，Zwierzchowski L.Nucleotide Sequence Variation in the Transcription FactorSTAT5Agene 5＇－noncoding Region in Bostaurus and Bos indicus Cattle［J］.Biochemical Genetics，2005，43：459－464.