秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法的比較試驗

徐文華，韓金濤，蔡 濤，辛小玲，白延琴，劉 超，辛亞平

反芻動物的瘤胃是一個極其復(fù)雜的微生物共生的生態(tài)系統(tǒng)，瘤胃微生物種類繁多，包括瘤胃原蟲、瘤胃細菌和厭氧真菌，還有少數(shù)的噬菌體，其中細菌的數(shù)量在瘤胃中占有很大比例［1］。

瘤胃微生物的區(qū)系十分復(fù)雜，且常因飼料種類、給飼時間、個體差異等因素而變化。瘤胃微生物主要為細菌、原生動物（主要包括鞭毛蟲、纖毛蟲）、真菌，但在消化中以厭氧性纖毛蟲和細菌為主，他們的種類和數(shù)量也最多。1g瘤胃內(nèi)容物中，約含細菌150～250億和纖毛蟲60～100萬，其總?cè)莘e約占瘤胃液的3.6%，其中細菌和纖毛蟲各約占50%（按容積計）。但就代謝活動的強度和其作用的重要性來說，則細菌遠遠超過纖毛蟲［2］。

反芻動物瘤胃微生物一直是一個研究熱點，但由于瘤胃是一個特殊的厭氧環(huán)境，采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)不但耗時耗力，而且不能全面了解瘤胃微生物［3］。直接提取樣品中微生物總DNA進行分析的方法，避開了純培養(yǎng)的步驟，減少了處理時間，而且能對很多難培養(yǎng)的微生物進行分析。本試驗采用珠磨法、反復(fù)凍融法、液氮研磨法、液氮研磨法結(jié)合CTAB法和SDS法提取DNA的效果進行了比較，并通過紫外吸收法鑒定，確定了一套更為簡便快速地提取秦川牛瘤胃微生物總DNA的有效方法［4］。

1 材料與方法

本試驗以秦川牛瘤胃為研究對象，比較秦川牛瘤胃微生物DNA各種提取方法的優(yōu)劣，并選擇最佳提取方法。

1.1 試驗材料

秦川牛瘤胃液在陜西眉縣秦寶牧業(yè)肉公司牛屠宰場取得，秦川牛瘤胃微生物DNA提取試驗在西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心實驗室進行。

1.1.1 試劑 十六烷基三甲溴化胺（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、蛋白酶K、瓊脂糖、酚：氯仿：異戊醇（1∶1∶1）、Tris、異丙醇、液氮、氯仿、磷酸鈉、70%冷乙醇，其他國產(chǎn)化學(xué)試劑均為分析純級。

1.1.2 主要儀器 高速臺式離心機、超聲波破碎儀、電熱恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、研缽、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 操作流程 詳見圖1。

1.2.2 采樣 采集瘤胃內(nèi)容物及瘤胃液，混勻，然后四層紗布過濾，濾液10000g離心5min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，放置－80℃保存。

1.2.3 破碎方法 試驗采用珠磨法等4種物理方法進行瘤胃微生物的細胞破碎，采用SDS和CTAB兩種化學(xué)方法進行細胞破碎液的DNA提取，因此，本試驗進行4×2＝8種提取方法的比較，每種方法均取樣品450μL。

圖1 秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法比較

珠磨法：樣品加入到裝有0.3g玻璃碎珠的小型離心管中，高速離心，加入抽提液，反復(fù)離心取上清。

反復(fù)凍融法：樣品中加入抽提液，放置液氮中2 min，然后迅速放置600℃水浴5min，此步驟重復(fù)3次，然后離心取上清。

超聲波破碎法：樣品中加入抽提液后，放置超聲波破碎儀中，功率100w，破碎時間為5min然后放置冰浴2min，此步驟重復(fù)兩次，然后離心取上清。

液氮研磨法：先將樣品中加入適量液氮瘤胃微生物的采集與處理，采集瘤胃內(nèi)容物及瘤胃液，混勻，然后4層紗布過濾，濾液10000g，離心5min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶液，放置－70℃保存。

1.2.4 DNA提取 珠磨－CTAB法：取秦川牛的瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液1.5mL加入到裝有0.3g玻璃碎珠的小型離心管中，在12000g的條件下離心5min，除去上清；加入1.5mL的PBS溶液在12000g的條件下離心5min，除去上清；加入800 μL CTAB Buffer（4g CTAB、16.364g NaCl、1 mol／L Tris·HCl，20mL pH 8.0、0.5mol／L EDTA 8mL，定容至200mL滅菌）Beat 120s在70℃條件下培養(yǎng)20min，然后在10000g條件下離心10 min將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入5μL的RNA酶（10mg／mL）在37℃條件下培養(yǎng)30min；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）溶液振蕩（15～30s）呈白色乳濁液13000r／min條件下離心10min，取上清加入到新的離心管中再用等體積酚：氯仿：異戊醇抽提至界面清晰為止。加入0.8 mL的異丙醇輕輕上下混勻幾次在室溫條件下放置5min讓DNA沉淀在－20℃過夜，在13000r／min條件下離心15～20min小心倒出上清可以看到灰白色的DNA沉淀加入750μL 70%的冷乙醇，將白色沉淀輕輕彈起在13000r／min條件下離心10～15min倒出上清，風干DNA加入100μL的TE Buffer（視沉淀體積而定）在70℃條件下5min，用分光光度計測定DNA的濃度［5］。

珠磨－SDS法：SDS buffer成分如下：100mmol／L NaCl、500mmol／L Tris.HCl PH 8.0、10%SDS，其他提取過程同珠磨－CTAB方法。

反復(fù)凍融－CTAB法：參照文獻凍融法和 Murrav等提出的CTAB方法，將凍融法和CTAB法相結(jié)合步驟如下：取秦川牛瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液0.5mL置于滅菌的2mL離心管中；加入400μL DNA抽提緩沖液（100mmol／LTris.HCI，pH 8.0；100mmol／L，DNA；100mmol／L磷酸鈉緩沖液，pH 8.0；1.5mol／LNaCl；1%CTAB）充分混勻，置液氮中完全凍結(jié)溫至融化；重復(fù)該步驟2次（液氮中冷凍約3～5min），取出在60℃水浴中保溫至融化；重復(fù)該步驟2次，共3次；60℃保溫1h，每隔15～20 min顛倒混勻幾次；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1），10000g，4℃離心10min；上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，重復(fù)2次如上清液仍渾濁，可增加1次；上清液中加1／10倍體積3mol／L乙酸鈉（pH 7.0）及2倍體積冷無水乙醇，輕輕混勻，置于－20℃過夜；10000g，4℃離心15min；沉淀用70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次，自然干燥；沉淀用100 uL TE，（pH 8.0）溶解；將其 DNA 原液進行稀釋后，取3μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察DNA純度，用分光光度計測定DNA的濃度其余DNA置于－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

反復(fù)凍融－SDS（蛋白酶K）法：取秦川牛瘤胃內(nèi)容物及其瘤胃液0.5mL置于滅菌的2mL離心管中；加900μL SDS提取液（100mmol／L NaC1，500 mmol／L Tris.HCl pH8.0，10%SDS），置液氮中完全凍結(jié)溫至融化；重復(fù)該步驟2次，（液氮中冷凍約3～5min），取出在60℃水浴中保溫至融化；重復(fù)該步驟2次，共3次；加入120μL蛋白酶K（20mg／mL）60℃保溫1h，每隔15～20min顛倒混勻幾次；6000g室溫離心10min；收集上清液，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1），10000g，4℃離心10min；上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，重復(fù)2次。如上清液仍渾濁，可增加1次；上清液中加1／10倍體積3mol／L乙酸鈉（pH 7.0）及2倍體積冷無水乙醇，輕輕混勻，置于－20℃過夜；10000g，4℃離心15min；沉淀用70%乙醇和冷無水乙醇各洗1次，自然干燥；沉淀用100μL TE，（pH8.0）溶解；將其DNA原液進行稀釋后，取3μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察DNA純度，用分光光度計測定DNA的濃度其余DNA置于－20℃下保存?zhèn)溆茫?］。

液氮研磨－CTAB法：先將瘤胃液樣品中加入適量液氮，在滅菌的研缽上快速研磨，然后加入抽提液CTAB Buffer（100mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸鈉緩沖液，pH8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反復(fù)顛倒數(shù)次，然后離心取上清6000r／min，離心5min，取上清，加20mg／mL 蛋白酶 K 10μL，65℃水浴，30 min，然后再加等體積酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，12000g，4℃離心2min取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h，16000g，4℃離心10min，棄上清用70%乙醇洗滌沉淀，晾干用TE（pH 8.0，含10 mg／uL RNase）溶解，放置37℃水浴30min酚和氯仿抽提1次，12000g，4℃離心2min上清加2倍體積乙醇，過夜16000g，4℃離心10min，棄上清70%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶于 TE（pH 8.0）。

液氮 研 磨－SDS 法：SDS Buffer 成 分：100 mmol／LNaCl，500mmol／LTris.HCl pH 8.0，10%SDS。將瘤胃液樣品中加入適量液氮，在滅菌的研缽上快速研磨，然后加入抽提液CTAB Buffer（100 mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸鈉緩沖液，pH 8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反復(fù)顛倒數(shù)次，然后離心取上清6 000r／min，離心5min，取上清，加20mg／mL蛋白酶K 10uL，65℃水浴，30min，然后再加等體積酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，12000g，4℃離心2min取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h，16000g，4℃離心10min，棄上清用70%乙醇洗滌沉淀，晾干用TE（pH 8.0，含10mg／μL RNase）溶解，放置37℃水浴30min酚和氯仿抽提1次，12000g，4℃離心2min上清加2倍體積乙醇，過夜16000g，4℃離心10min，棄上清70%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶于 TE（pH 8.0）［7］。

超聲波破碎－CTAB法：取瘤胃樣1.5mL；，樣品中加入400μL CTAB抽提液，CTAB Buffer（100 mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸鈉緩沖液，pH 8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反復(fù)顛倒數(shù)次后，放置超聲波破碎儀中，功率100w，破碎時間為5min然后放置冰浴2min，此步驟重復(fù)兩次，然后離心取上清。

超聲波破碎－SDS法：取瘤胃樣1.5mL，樣品中加入加900μLSDS提取液（100mmol／L NaC1，500 mmol／L Tris.HCl pH 8.0，10%SDS），反復(fù)顛倒數(shù)次后，放置超聲波破碎儀中，功率100w，破碎時間為5min然后放置冰浴2min，此步驟重復(fù)兩次，然后離心取上清。

2 結(jié)果

秦川牛瘤胃微生物DNA的純度及濃度檢測結(jié)果見表1。

3 討論

由表1可以看出，粗提的DNA的OD 260／OD 280比值大概在1.0～1.05之間，純度都比較低，樣品中含有很多雜質(zhì)，須經(jīng)進一步純化以便后續(xù)應(yīng)用；在珠磨法中，用CTAB抽提液獲得的DNA濃度高于用SDS提抽液提取的DNA濃度。

在反復(fù)凍融法中，用SDS提取液的效果明顯高于其它。在液氮研磨法中，所提取的DNA效果差異不明顯，效率亦不高。在超聲波法中，實際操作所獲得的DNA提取效果差。

對不同方法提取的DNA樣品進行電泳檢測，上樣量均為8μL。瘤胃微生物DNA片段分子量在20kb左右，表明己獲得較大片段的瘤胃微生物基因組DNA。珠磨－CTAB法可以獲得比較完整的瘤胃微生物總DNA片段，但是明顯具有拖尾現(xiàn)象，而在加入CTAB提取液后，將樣品放置65℃水浴幾分鐘，提取DNA的效果更好。珠磨－CTAB法的濃度均比其他方法高微弱，并且RNA仍未降解完全，同時在點樣仍存在多糖和大分子不明雜質(zhì)。珠磨－SDS法提取的DNA條帶也明顯具有拖尾現(xiàn)象，說明DNA降解嚴重。

表1 秦川牛瘤胃微生物DNA的純度及濃度檢測結(jié)果

通過條帶可見反復(fù)凍融－SDS法提取的DNA的質(zhì)量優(yōu)于反復(fù)凍融－CTAB法，可以獲得比較完整的DNA片段，并且在該方法的凝膠泳道前部，可見較亮的RNA譜帶，說明提取物中存在未降解完全的RNA，需要進行下一步的純化。

從DNA提取的效果看，同時在電泳點樣膠孔中含有很多的多糖和大分子不明雜質(zhì)，并且提取的DNA仍有一定的降解。

液氮研磨法與CTAB和SDS兩種化學(xué)方法提取DNA條帶亮度較之珠磨法和反復(fù)凍融法稍暗，有拖尾現(xiàn)象且RNA仍未降解完全，同時在點樣仍存在多糖和大分子不明雜質(zhì)，很難保證片段的完整性。

超聲波法破碎細胞能力較之其他方法差，提取DNA用此方法效果一般。

4 結(jié)論

以秦川牛瘤胃微生物為對象，采用珠磨法、反復(fù)凍融法、液氮研磨法、超聲波法提取DNA。從DNA提取效果來看，珠磨－CTAB法和反復(fù)凍融法可以獲得相對比較完整的瘤胃微生物總DNA片段，純化后的DNA含量高。

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