固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因多態(tài)性與肉用性狀關(guān)系的研究

滑留帥，楊曉冰，楊 奇，胡沈榮，陳 宏＊

引言

固原市位于寧夏回族自治區(qū)南部山區(qū)，是一個歷史悠久的肉牛基地。固原本地的黃牛品系，基本是陜西秦川牛的后裔或直接從陜西引進的秦川牛，以役用為主。上個世紀(jì)70年代，政府開始有組織的進行黃牛雜交改良，先后引進過短角牛、西門塔爾牛等國外優(yōu)良品種進行雜交改良，但推廣范圍都有限。2000年以后，固原市推行退耕還林還草政策，并把草畜產(chǎn)業(yè)作為第一支柱產(chǎn)業(yè)，大力推廣利木贊牛的雜交改良，目前已有很大的利木贊牛雜交群體。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）是一族分子質(zhì)量為14kD～16kD的蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動物的小腸、肝、心、腦和骨骼肌等多種細胞內(nèi)，并且含量豐富［1］，目前，已發(fā)現(xiàn)9種組織特異性的胞質(zhì)FABP，其中 H－FABP（heart fatty acid－binding proteins，H－FABP）對動物脂肪代謝有重要作用，H－FABP在細胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進細胞攝取脂肪酸［2，3］，H－FABP基因敲除小鼠表現(xiàn)出對外圍長鏈脂肪酸利用的嚴(yán)重缺陷。FABP家族成員還與細胞生長和增殖的調(diào)節(jié)有關(guān)，H－FABP能調(diào)節(jié)新生小鼠心肌細胞的生長和分化、它還能刺激細胞表面積的增加，從而導(dǎo)致心肌細胞的肥大［4］；而且，H－FABP尤其抑制小鼠正常乳房上皮細胞的生長，H－FABP還被認(rèn)為是乳房腫瘤的抑制基因。種間H－FABP基因編碼區(qū)有很高的同源性，這不僅表現(xiàn)在所編碼的氨基酸上，還表現(xiàn)在DNA序列上［5］。所有FABP基因家族成員基因結(jié)構(gòu)都是保守的，有4個外顯子和3個內(nèi)含子組成［6］，研究證實H－FABP基因是影響脂肪性狀的主要候選基因［7］，從而對肉品質(zhì)有重要影響，由于其影響脂肪代謝，并同時推測其對動物的生長發(fā)育也存在影響。

本研究利用PCR－RFLP研究了固原本地黃牛及其利木贊牛雜交群體H－FABP－HaeIII位點多態(tài)性及其與屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的關(guān)系，以期為固原本地黃牛下一步的雜交改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為隨機抽取的41頭固原本地黃牛和121頭利木贊牛與固原本地黃牛的雜交1代牛（簡稱利雜牛），頸靜脈采血，ACD抗凝，－80℃保存。然后在其中選取18月齡和6月齡利雜牛公牛各6頭，18月齡和6月齡固原本地公牛各6頭，共計24頭進行6個月的育肥試驗后，進行屠宰性能測定和肉品質(zhì)測定。屠宰試驗在寧夏六盤山?jīng)芎忧逭媸称酚邢薰具M行。

1.2 主要試劑

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HaeIII等購自MBI（Fermantas）和上海生物工程有限公司。

1.3 固原本地黃牛及其利雜群體基因組DNA的提取

血樣基因組DNA的提取采取酚氯仿法［8］。

1.4 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR擴增

引物序列參考文獻［13］，上游序列5′－ AGCCTACCACAATCATCGAAGTGAA －3′；下游序列 5′－ CAAGTGATGTCTCTTGTCCATTCCA－3′，由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系為25μL：10×Buffer 2.5μL，MgCl2（25mmol／L）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol／L）2.0μL、Taq DNA 聚合酶（2U／μL）0.5μL，上下游引物（10pmol／μL）各0.4μL，模板 DNA（50ng／μL）1.5μL，加三蒸水至25μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，（94℃變性30s，65℃復(fù)性45s，72℃延伸1min）34個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.5 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR－RFLP分析

圖1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產(chǎn)物電泳圖

酶切反應(yīng)體系：10×緩沖液R（含BSA）2μL，HaeⅢ（10U／μL）0.7μL，PCR產(chǎn)物10μL，補三蒸水至20μL，經(jīng)瞬時離心后置于37℃恒溫水浴搖床中消化過夜，消化后PCR產(chǎn)物用4g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測、成像。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因型與基因頻率、適合性χ2檢驗均利用POPGENE軟件完成。與生產(chǎn)數(shù)據(jù)的相關(guān)分析采用最小二乘線性模型，不同育肥階段的方差分析模型如下：Y＝μ＋breed＋marker＋e其中：Y為個體表型的記錄值；μ為群體平均值；breed為品種效應(yīng)；marker為標(biāo)記基因型效應(yīng)；e為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR－RFLP分析

固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產(chǎn)物片段大小為2 075bp（圖1），用 HaeIII限制性內(nèi)切酶消化后表現(xiàn)多態(tài)性（圖2，只顯示部分多態(tài)片段）：AA型表現(xiàn)為7條帶，片段大小分別為73 bp、124bp、146bp、169bp、312bp、599bp、653bp，BB型表現(xiàn)為8條帶分別為73bp、124bp、146bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp，即在 AA型中的653bp的片段在BB型中被切為166bp和487 bp，AB型表現(xiàn)為9條帶，分別73bp、124bp、146 bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp、653bp，即在雜合子中所有片段大小的帶都出現(xiàn)。然而僅就487bp、599bp、653bp三條帶就能將牛進行分型（圖2）。

2.2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態(tài)性分析

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經(jīng)HaeIII的酶切后表現(xiàn)多態(tài)性，且均在該位點處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)；等位基因A／B頻率分別為0.7439／0.2561和0.7190／0.2810，利雜群體位點雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)均大于固原本地黃牛群體。

圖2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座酶切電泳圖

表1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

2.3 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座不同基因型與部分屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

考慮品種效應(yīng)、標(biāo)記基因型效應(yīng)及其它們之間的互作，在不同年齡階段對屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀進行兩因素方差分析，由表2可知：AB型個體的心重大于AA型個體，差異顯著（P＜0.05）；而腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、系水力、粗脂肪含量，AB型個體均高于AA型個體，同時AB型個體的肌肉剪切力、粗蛋白含量小于AA型個體，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座基因型間最小二乘均值差異顯著性檢驗

3 討論

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經(jīng)HaeIII的酶切后表現(xiàn)多態(tài)性，且均在該位點處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)，說明在這個位點受到的選擇壓力不大，這可能是因為H－FABP基因與脂肪性狀或肉品質(zhì)性狀相關(guān)，而這些性狀都是不太容易測量的，所以在選種時，選擇強度可能不大，目前在肉牛業(yè)越來越重視肉品質(zhì)的趨勢下，應(yīng)該在以后的選種過程中加大選擇的力度，提高群體的肉品質(zhì)水平。利雜群體位點雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)均大于固原本地黃牛群體，說明用利木贊牛的雜交改良豐富了固原本地黃牛在該位點上的遺傳資源，為后期的選種工作提供了更豐富的素材，同時，用利木贊牛的雜交改良提高了固原本地黃牛群體中B等位基因的基因頻率。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）在脂肪酸生成過程中具有重要的生物學(xué)功能，參與細胞內(nèi)脂肪酸的運輸，調(diào)整細胞內(nèi)脂肪酸的濃度。它們能在心肌和脂肪細胞中沉積甘油三酯，這是增加肌內(nèi)脂肪含量（intramuslar Fat，IMF）的主要方向，10%左右的IMF可產(chǎn)生理想的大理石花紋，從而形成優(yōu)質(zhì)高檔牛肉［9］。據(jù)研究，牛肉大理石花紋性狀與牛肉的嫩度高度相關(guān)，較高水平的大理石花紋可以提高牛肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味，減少牛肉在烹調(diào)過程中嫩度的變化。目前對H－FABP基因的研究多集中在豬上和雞上，少數(shù)涉及牛，Gerbens等［10］利用侯選基因法的研究表明H－FABP基因的遺傳變異與肌內(nèi)脂肪含量存在相關(guān)，在杜洛克豬中存在MspI、HaeIII和HinfI酶三個多態(tài)性酶切位點，并初步發(fā)現(xiàn)H－FABP基因的純合單倍體“aa dd HH”與高肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)，H－FABP基因被認(rèn)為是影響肌內(nèi)脂肪沉積的主效基因。龐衛(wèi)軍等（2005）報道，利用 PCR－RFLP（MspI、HaeIII和HinfI3種限制性內(nèi)切酶）分子標(biāo)記技術(shù)，檢測了杜洛克豬、長白豬、大白豬、內(nèi)江豬、榮昌豬、漢江黑豬、漢中白豬、八眉豬和野豬共計265頭豬H－FABP基因5＇－上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)的遺傳變異，并利用最小二乘模型分析了H－FABP基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪含量的遺傳效應(yīng)。結(jié)果表明，H－FABP基因可顯著地提高IMF含量（P＜0.05），可以通過提高“aa－dd－HH”基因型的頻率達到改善群體豬肉質(zhì)的目的［11］。李文娟等（2006）利用RT－PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)，分析了H－FABP基因與雞肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)系，結(jié)果表明，H－FABP基因mRNA隨日齡的增長表達量顯著降低，北京油雞、白萊航雞和AA雞群體的H－FABP基因mRNA表達水平與IMF含量及胴體重呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)［12］。周國利等［13］報道，魯西黃牛H－FABP基因中BB純合基因型對牛肉嫩度剪切力值有較大的影響（P＜0.05），同時，對于腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、系水力等指標(biāo)，AB型均高于AA型，在本試驗研究的群體中，除心重指標(biāo)AB型顯著大于AA型（P＜0.05）外，基因型對腎脂肪重、脂肪色澤評分、眼肌面積、肌肉嫩度、系水力、肉品粗脂肪含量等指標(biāo)均影響不顯著，但都呈現(xiàn)AB基因型優(yōu)于AA型的趨勢，初步認(rèn)為B等位基因與優(yōu)良生產(chǎn)性能相關(guān)。本研究因為樣本量限制，沒有檢測到BB型個體，應(yīng)該進一步擴充樣本量，使BB型數(shù)量到可統(tǒng)計的水平，以提高研究的準(zhǔn)確性。

［1］Niewold T A，Meinen M，Van der Meulen J.Plasma intestinal fatty acid binding protein concentrations increase following intestinal ischemia in pigs［J］.Res Vet Sci，2004，77（1）：89－91.

［2］Wang Q，Li H，Liu S，etal.Cloning and tissue expression of chicken heart fatty acid－binding protein and intestine fatty acidbinding protein genes［J］.Anim Biotechnol，2005，16（2）：191－201.

［3］姜延志，李學(xué)偉.豬I－FABP基因的分子克隆與組織特異性表達分析［J］.遺傳學(xué)報，2006，33（2）：125－132.

［4］Tang M K，Kindler P M，Cai D Q，etal.Heart－type fatty acid binding proteins are upregulated during terminal differentiation of mouse cardiomyocytes，as revealed by proteomic analysis［J］.Cell Tissue Res，2004，316：339－347.

［5］陳志輝，許良梅，單安山.脂肪酸結(jié)合蛋白及其基因［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（5）：689－692.

［6］Hertzel V A，Bernlohr D A.The mammalian fatty acid－binding protein multigene family：molecular and genetic insight into function［J］.TEM，2000，11：175－180.

［7］高 妍，張永宏，李 毅，等.脂肪酸結(jié)合蛋白研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（1）：64－67.

［8］Chen Hong，Leibenguth F.Studies on multilocus fingerprints，RAPD markers and mitochondrial DNA of a gynogenetic fish（Carassius auratus gibelio）［J］.Biochemical Genetics，1995，33：297－306.

［9］李武峰，許尚忠，曹紅鶴，等.3個雜交牛種H－FABP基因第二內(nèi)含子的遺傳變異與肉品質(zhì)性狀的相關(guān)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35（3）：252－25.

［10］Gerbens F，VanArendonk A，TePas M.The effect of adipocyte and heart fatty acid binding protein genes on intramuscular fat and back fat content in Meishan cross bredpigs［J］.J.Anim.Sci.，2000，78（3）：552－559.

［11］龐衛(wèi)軍，孫世鐸，李 影，等.西部地區(qū)主要豬種和野豬 HFABP基因分子標(biāo)記與IMF含量關(guān)系［J］.遺傳，2005，27（3）：351－356.

［12］李文娟，李宏賓，文 杰，等.雞 H－FABP和 A－FABP基因表達與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（5）：417－423.

［13］周國利，朱 奇，郭善利，等.魯西黃牛H－FABP基因的多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀關(guān)系的分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，14（3）：5－7.