紅芪多糖影響實(shí)驗(yàn)性脾虛大鼠胃黏膜中p53基因蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

萬(wàn)生芳，張本忠

(1．甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000;2．蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

紅芪是豆科植物多序巖黃芪(Hedysarum Polybotrys Hand．-Mazz)的干燥根，主產(chǎn)甘肅，效同黃芪。臨床常將紅芪代替黃芪使用［1］?，F(xiàn)代研究［2］證實(shí)，紅芪中含有多種生物活性物質(zhì)，且含有黃芪中不存在的抗菌成分1-3-羥基-9甲氧基紫檀烷等［3］，且有鎮(zhèn)痛、抗炎、耐缺氧、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-6］。本研究觀察了紅芪多糖影響胃黏膜病變相關(guān)因子表達(dá)狀況，以探討紅芪多糖在防治胃黏膜病變方面的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物

Wistar大鼠，SPF級(jí)，雄性，鼠齡 80～100 d，體質(zhì)量(200±10)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(甘)2011-0001。

1．2 藥品、試劑與儀器

紅芪，選用甘肅宕昌GAP種植基地產(chǎn)紅芪，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為豆科巖黃芪屬植物多序黃芪(Hedysarum polybotrys．hand．-Mazz)的干燥根莖，等級(jí)優(yōu);大黃，選用甘肅隴南地區(qū)GAP種植基地產(chǎn)大黃，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為掌葉大黃(Rheum palmatum)的根，等級(jí)優(yōu)。鼠抗人p53單克隆抗體，研域上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)RC1430;SABC-FITC(大鼠IgG)試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào) SA1069;黃芪多糖，北京美迪克斯生物科技有限公司提供，批號(hào)HD006001。BX51/BX52型 Olympus系統(tǒng)顯微鏡，產(chǎn)地日本;LEICACM1900型恒冷箱切片機(jī)，產(chǎn)地德國(guó);免疫組化載玻片，Poly-L-Lysine材質(zhì)，武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．3 藥品的制備

紅芪多糖的制備：將1 000 g紅芪飲片加入5 000 mL水，浸泡1 h;煎煮30 min，趁熱抽濾;再加入5 000 mL水2次煎煮30 min，趁熱抽濾;2次藥液混合，冷卻后加無(wú)水乙醇至含醇量600 g/L，靜置24 h;抽濾，濾液用無(wú)水乙醇和乙醚依次沖洗沉淀，沉淀物即為紅芪多糖;60℃烘干備用。

制備1000 g/L大黃水煎液：大黃飲片500 g，加入2 500 mL水，浸泡1 h;煎煮30 min，濾渣;2次煎煮;2次藥液混合，明火沸騰至藥液量達(dá)800 mL;將藥液置于60℃水浴鍋內(nèi)，濃縮至500 mL，即為1 000 g/L大黃水煎液(每mL含生藥1g)。

1．4 動(dòng)物分組與脾虛證模型的建立

將60只大鼠隨機(jī)分空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，黃芪多糖高、中劑量組及紅芪多糖高、中劑量組。每組10只?？瞻讓?duì)照組大鼠不予特殊處理，正常飼養(yǎng);其余5組參照文獻(xiàn)［7-9］制備脾虛證模型。用1 000 g/L大黃水煎液75 μL/g體質(zhì)量，每天灌胃，1 d 2次，連續(xù)42 d。密切觀察大鼠一般情況。若有食欲不振(食量減少)、消瘦(體質(zhì)量下降)、大便稀溏、肛門污穢、倦怠乏力(懸空拉尾抵抗力減弱)、毛發(fā)不榮、萎靡嗜睡、瞇眼等癥狀，則提示造大鼠脾虛模成功。

1．5 用藥方法

參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［10］人與大鼠體表面積比計(jì)算給藥劑量。黃芪多糖人常規(guī)用量為50 mg/60 kg體質(zhì)量，則大鼠中劑量組合理給藥量為0．025 mg/g體質(zhì)量，高劑量組給藥量為0．05 mg/g體質(zhì)量。加蒸餾水將黃芪多糖分別配制為10 g/L、5 g/L的溶液，按高、中劑量在造模后第2天開始對(duì)黃芪多糖高、中劑量組大鼠分別進(jìn)行灌胃，每天0．005 mL/g體質(zhì)量，連續(xù)灌胃30 d;加蒸餾水將紅芪多糖分別配制為10 g/L、5 g/L的溶液，按高、中劑量在造模后第2天開始對(duì)紅芪多糖組大鼠分別進(jìn)行灌胃，每天5 μL/g體質(zhì)量，連續(xù)灌胃30 d。

1．6 檢測(cè)指標(biāo)

造模后第2天，處死空白對(duì)照及模型對(duì)照組大鼠，取大鼠胃標(biāo)本按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色;各藥物組于用藥第31天，斷頸處死所有大鼠;取大鼠胃，沿胃大彎剪開;將標(biāo)本放入100 g/L甲醛固定液中;固定后以石蠟包埋，連續(xù)切片(厚 度4 μm);經(jīng)冷丙酮固定;PBS沖洗后加入體積分?jǐn)?shù)10%的封閉用正常兔血清，置室溫3 h;加兔抗大鼠p53多抗，體積為1∶50;DAB顯色液進(jìn)行顯色，光鏡觀察。陰性對(duì)照者用PBS代替一抗。所有標(biāo)本一次測(cè)定。

用已知的陽(yáng)性組織切片做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS作陰性對(duì)照，用DAB染色，p53細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。讀片時(shí)每張切片分別取上、下、左、右及中心共5個(gè)區(qū)域的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)區(qū)計(jì)數(shù)100個(gè)黏膜細(xì)胞，共計(jì)數(shù)500個(gè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。組間百分率的比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)。以P＜0．05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型對(duì)照組p53陽(yáng)性表達(dá)率較空白對(duì)照組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);紅芪多糖高、中劑量組，黃芪多糖高劑量組p53陽(yáng)性表達(dá)率較模型對(duì)照組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);黃芪多糖高、中劑量組之間p53陽(yáng)性表達(dá)率存在顯著差異(P＜0．01)，紅芪多糖高、中劑量組之間p53陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)差異(P＞0．05)。見(jiàn)表1。

表1 各組p53陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)比

3 討論

p53基因是目前研究最廣泛和深入的一種抑癌基因。野生型p53在細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程中能監(jiān)視基因組DNA的完整性，修復(fù)DNA的損傷，還能啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡過(guò)程，引導(dǎo)具有癌變傾向的突變細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。突變型p53則具有致癌作用［11］。p53基因突變常導(dǎo)致其抑制癌作用的喪失，還可能促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。p53的高表達(dá)與癌關(guān)系密切，因此若胃黏膜病變中p53陽(yáng)性表達(dá)，臨床就必須高度警惕。吳蘇冬等［12］研究表明，脾虛大鼠胃黏膜的損傷指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組。也有學(xué)者提出，脾虛是胃癌發(fā)生、發(fā)展的一種機(jī)體內(nèi)部的基礎(chǔ)和條件。劉曉穎等［13］研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證慢性萎縮性胃炎的相關(guān)癌基因p53表達(dá)異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組p53的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組，說(shuō)明脾虛證大鼠胃黏膜的損傷指數(shù)較高，如果脾虛證不加以治療，有可能發(fā)展為胃黏膜癌前病變。

紅芪作為傳統(tǒng)中藥材，其主要功效是補(bǔ)氣固表，斂瘡生肌，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅芪多糖降低了脾虛證大鼠胃黏膜p53表達(dá)率與含量，提示紅芪多糖對(duì)脾虛證胃黏膜組織中p53的表達(dá)有一定抑制作用，通過(guò)減少p53基因的表達(dá)，從而增加了胃黏膜細(xì)胞凋亡，進(jìn)而阻止脾虛證大鼠胃黏膜進(jìn)一步發(fā)生病變。

此外，本實(shí)驗(yàn)中紅芪多糖和黃芪多糖的作用沒(méi)有顯著差異，提示我們?cè)谂R床實(shí)際工作中，可以用紅芪來(lái)代替黃芪。今后，本課題組將繼續(xù)對(duì)紅芪進(jìn)行更深入的研究，為甘肅的道地中藥材紅芪產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。

［1］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所．中藥志［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：195．

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