超聲波和加熱處理對三疣梭子蟹肝胰腺絲氨酸蛋白酶的影響?

武丹露， 楊利珠， 張燕茹， 張 莉

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266003)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)作為重要的海洋經(jīng)濟蟹類，含有豐富的蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)及微量元素。三疣梭子蟹死后肌肉極易軟化，很快出現(xiàn)空殼現(xiàn)象，不耐貯存。許多水產(chǎn)品在加工及貯藏過程中易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，有研究表明水產(chǎn)品中的內(nèi)源酶直接或間接地加速了自身的肌肉軟化[1-2]，促進了自溶現(xiàn)象的發(fā)生。從海水魚藍圓鲹(Decapterusmaruadsi)肌肉中分離純化的可溶性絲氨酸蛋白酶，可強烈分解明膠和膠原蛋白，推測該絲氨酸蛋白酶參與魚死后肌肉中膠原蛋白的分解，從而使肌肉軟化[3]。三疣梭子蟹中也存在大量的蛋白酶類，其在分解自身蛋白和加速肌肉軟化方面可能發(fā)揮著重要作用，因此合理控制蛋白酶類活性對于保障產(chǎn)品品質(zhì)顯得尤為重要。

酶變性失活的方法，大致可分為化學(xué)變性法和物理變性法?；瘜W(xué)變性包括酸堿處理以及蛋白酶抑制劑處理，物理變性包括加熱、超高壓、超聲和微波處理等。物理變性中又分為熱處理和冷處理法，如加熱屬于熱處理，超高壓和超聲則屬于冷處理。超聲波釋放的能量也能使酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致酶的功能發(fā)生變化[4]。近年來，超聲波技術(shù)作為一種非熱加工方式已廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)中，食品中酶的超聲鈍化成為研究熱點[5]，對果汁、乳制品的鈍酶效果已被廣泛報道[6-7]。本研究為探討不同處理方式對酶的影響，選取了超聲和加熱兩種處理方式處理實驗室制備的三疣梭子蟹肝胰腺中絲氨酸蛋白酶(S75-1)，對其結(jié)構(gòu)和活性變化進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活的三疣梭子蟹，平均質(zhì)量162 g左右，觀察體表健康無病。購于青島市團島海鮮市場，冰溫運輸，30 min內(nèi)到達實驗室后立即處理，取出內(nèi)臟放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

Boc-Phe-Ser-Arg-MCA(PEPTIDE INSTITUTE, INC公司)；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(Sigma 公司)；電泳標準蛋白樣液(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(AP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)(上海索萊寶生物科技有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甲醇、異丙醇、丙酮、冰醋酸(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司); Q Sephrose Fast Flow凝膠、Superdex 75凝膠(美國GE Healthcare公司)。

DYC-24D型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；DYY-Ⅲ-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；Gel DocTM XR型凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)；UV-2012PC紫外分光光度計(龍尼柯上海儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(精宏實驗設(shè)備有限公司)；KH5200DE型超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司)；F-4600型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；DS-1高速組織搗碎機(無錫沃信儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲氨酸蛋白酶的提取 以三疣梭子蟹的肝胰腺為原料，分離純化絲氨酸蛋白酶，具體參照前期方法[8]和Klomklao等[9]報道方法。提取制備流程：螃蟹取肝胰腺60 g→以料液比1∶3(w/v)比例加入180 mL丙酮(-20 ℃)→組織搗碎機勻漿3 min→4層濾紙真空抽濾→殘留物風(fēng)干后獲得粗酶粉末→以料液比1∶4(w/v)比例加入240 mL預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液(50 mol/L, pH=7.5)→勻漿1 h→靜置3 h→離心15 min(4 ℃，12 000 r/min)→上清液即為粗酶液→對粗酶液進行30%～70%硫酸銨沉淀→沉淀用緩沖液復(fù)溶、透析→酶液進行Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析(0.4～1.2 mol/L NaCl)→Superdex 75 凝膠過濾→獲得純化絲氨酸蛋白酶(記為S75-1)。

1.2.2 超聲處理 取10 mL上述純化后的酶液S75-1，經(jīng)稀釋后采用功率依次為0、100、200、300、400和500 W超聲波處理2 min；在功率為200 W超聲波下對酶液分別處理0、2、4、6、8和10 min。處理后酶液采用熒光法測定吸光值，依據(jù)1.2.4中方法計算相對酶活力百分數(shù)。其中超聲間歇比2∶1 (超聲2 s，間歇1 s)。

取10 mL未經(jīng)稀釋的酶液，在超聲功率200 W作用下，處理30 min，隨后再在400 W功率下處理20 min，超聲間歇比2∶1 (超聲2 s，間歇1 s)。處理后酶液進行紫外光譜、熒光光譜和SDS-PAGE變性凝膠電泳分析。

1.2.3 加熱處理 將純化后的酶液稀釋103倍后，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，采用熒光法測定酶活力。具體操作為：將反應(yīng)液(0.8 mL緩沖液、0.1 mL酶液和0.1 mL熒光底物的混合液)分別放入4、20、30、40、50、60、65、70和80 ℃水浴鍋中，反應(yīng)10 min后用1.5 mL熒光終止液終止反應(yīng)；反應(yīng)液用熒光分光光度計在激發(fā)波長380 nm和發(fā)射波長450 nm下測定熒光吸光值，計算相對酶活力百分數(shù)，測定其最適溫度。

取1 mL稀釋后的酶液放置于上述各溫度下孵育15 min后，立即放入冰水中，用熒光法測定吸光值，計算相對酶活力百分數(shù)，測定酶的熱穩(wěn)定性。

取1 mL未經(jīng)稀釋的酶液，在65 ℃下加熱處理15 min。處理后的酶液與未經(jīng)處理的酶液進行紫外光譜和熒光光譜分析。

取1 mL未經(jīng)稀釋的酶液，在65 ℃下分別加熱30 s、60 s、5 min、10 min、15 min。將處理后的酶液與未經(jīng)處理的酶液進行SDS-PAGE變性凝膠電泳。

1.2.4 絲氨酸蛋白酶活力的測定 參照Yoshida等[10]的方法，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，用熒光法測定酶活力。取0.1 mL待測樣品加入0.8 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH=7.5)，隨后加入0.1 mL ，50 μmol/L熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，在55 ℃下反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL熒光終止液(甲醇∶異丙醇∶水=35∶35∶30)終止反應(yīng)?；靹蚝螅诩ぐl(fā)波長 380 nm和發(fā)射波長450 nm下測定其吸光值。以加入0.9 mL緩沖液、0.1 mL熒光底物和1.5 mL熒光終止液作為空白對照。每個樣品作3組平行試驗。該條件下，定義每分鐘水解產(chǎn)生1 nmol AMC的酶量為一個蛋白酶活力單位(U)。

1.2.5 紫外光譜 外界條件的影響能造成蛋白質(zhì)紫外光譜峰位的變化。將經(jīng)過超聲和加熱處理的樣品與未經(jīng)過處理的酶液，用紫外分光光度計進行紫外光譜掃描，波長范圍為230～320 nm。

1.2.6 常規(guī)內(nèi)源熒光 將待測樣品進行熒光光譜掃描，其中激發(fā)波長為280 nm時，發(fā)射光譜掃描范圍300～400 nm；激發(fā)波長為295 nm時，發(fā)射光譜掃描范圍320～370 nm。激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度5 nm，掃描速率1 200 nm/min。

1.2.7 同步內(nèi)源熒光 將待測樣品分別在波長差為15和60 nm下進行同步熒光掃描。同步熒光測定Δλ=15 nm時，掃描范圍為270～320 nm；Δλ=60 nm時，掃描范圍為250～320 nm。激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度5 nm，掃描速率1 200 nm/min。

1.2.8 SDS-PAGE 將待測樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：12%分離膠，5%濃縮膠，4倍上樣緩沖液，上樣量15μL，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V；Marker分子質(zhì)量為(6.5～200 kD)。電泳后，采用考馬斯亮藍R250染色30 min，甲醇和冰醋酸混合液脫色后進行對比分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS 19.0和OriginPro8.5。試驗結(jié)果取3次平行試驗的平均值，并進行了顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對絲氨酸蛋白酶S75-1酶活力的影響

超聲波處理會對酶的活性造成重要影響。不同超聲功率對S75-1酶活力的影響情況，如圖1A所示。在超聲處理2 min條件下，不同超聲波功率對S75-1的相對酶活力百分數(shù)均有極顯著性影響(P<0.01)。當(dāng)超聲波功率為100 W時，S75-1的相對酶活力百分數(shù)顯著性上升了6.93%，當(dāng)超聲波的功率超過100 W后，隨著超聲波功率的增加，其相對酶活力百分數(shù)逐漸降低；當(dāng)功率達到500 W時，S75-1相對酶活力百分數(shù)降低了37.53%。

在超聲波功率100 W情況下，不同處理時間對S75-1的相對酶活力百分數(shù)均有極顯著性影響(P<0.01)，如圖1B所示。當(dāng)超聲處理時間為2 min時，S75-1相對酶活力百分數(shù)顯著上升6.44%，此結(jié)果也與上述超聲波功率處理結(jié)果相一致；當(dāng)超聲的處理時間達到10 min時，相對酶活力百分數(shù)降低59.71%。由此可知，小功率、短時間超聲波處理可顯著增加S75-1的酶活力，但隨著超聲功率及處理時間的延長，酶活力會顯著降低。

(A.超聲時間2 min; B.超聲功率200 W。A.Ultrasonic time 2 min;B.Ultrasonic power 200 W.)圖1 超聲功率(A)和超聲時間(B)對絲氨酸蛋白酶S75-1活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power (A) and time (B) treatment on the activity of serine enzyme S75-1

酶作為一種生物大分子，其活力的保持取決于酶的分子構(gòu)象。超聲波作用于酶分子時，所釋放出的能量可能會使酶分子構(gòu)象發(fā)生變化；若能量強度適中，在促使酶分子能量增加和介質(zhì)溫度增大的同時，也會使酶分子的微結(jié)構(gòu)更加合理，從而使酶表現(xiàn)出更高的催化活性[11]。很多文獻提出，在一定條件下，超聲處理能增加某些酶的酶活，如超聲功率250 W條件下，處理10 min能將胰蛋白酶水解率提高33%[12]。Vargas[13]等用20 kHz超聲波處理器處理黑曲霉中轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)在振幅為20%的情況下，處理8 min能顯著提高轉(zhuǎn)移酶活；Wang J[14]等指出當(dāng)超聲條件為超聲強度0.5 W/cm2、超聲頻率40 kHz時，蒜氨酸酶活顯著提高。本試驗中隨著功率或時間的增加，絲氨酸蛋白酶酶活力降低，也與文獻[15-17]報道結(jié)果類似，其可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈基團發(fā)生了變化，導(dǎo)致了酶的聚合，影響了酶的活性位點，從而降低了酶的穩(wěn)定性[18]，也可能是加熱處理使酶中部分結(jié)構(gòu)降解從而失活[16]。

2.2 加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1酶活力的影響

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，溫度為橫坐標，相對酶活力為縱坐標繪制曲線。

由圖2A結(jié)果可見，不同溫度對S75-1的相對酶活力有顯著性影響(P<0.05)。當(dāng)處理溫度為4～60℃時，S75-1相對酶活力隨溫度的升高而增加；當(dāng)溫度達到60℃時，S75-1的相對酶活力達到最大；但當(dāng)溫度超過60℃后，其相對酶活力逐漸降低；當(dāng)溫度超過65℃后，相對酶活力極顯著降低(P<0.01)，其相對酶活力不到30%。由圖2B可見，S75-1在低于55℃下孵育15 min，相對酶活均保持在80%以上，其在50℃時具有最高酶活力，然后隨著溫度的升高相對酶活力呈下降趨勢，當(dāng)溫度到達65℃以上時，S75-1酶活幾乎全部喪失。

絲氨酸蛋白酶S75-1在以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物時，在反應(yīng)溫度為60℃時酶活最大，此結(jié)果與遠洋梭子蟹(Portunuspelagicus)[19]類胰蛋白酶和鯰魚(Clariasmacrocephalus×Clariasgariepinus)[20]內(nèi)臟中胰蛋白酶的最適溫度60℃相同，高于以BAPNA為底物測定藍魚(Pomatomussaltatrix)[21]幽門盲囊中胰蛋白酶的最適溫度55℃，高于以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物測定皇家紅蝦(Haliporoidessibogae)[22]胰蛋白酶的最適溫度50℃，以及同樣以此底物測定日本鱸魚(Lateolabraxjaponicus)[23]肝胰腺中2種胰蛋白酶的最適溫度40℃。不同生物同種類型的酶最適溫度也有所不同，這可能是由于不同生物生長環(huán)境的溫度不同導(dǎo)致的。

在熱穩(wěn)定性研究中，絲氨酸蛋白酶S75-1在溫度低于55℃時均保持較高活性，超過此溫度后，酶活力開始

(A.最適溫度; B.熱穩(wěn)定性。A.Optimum temperature;B.Thermal stability.)圖2 加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1酶活力的影響Fig.2 Effect of heat treatment on the enzyme activity of serine protease S75-1

降低。遠洋梭子蟹[19]類胰蛋白酶為65℃，鯰魚[20]內(nèi)臟中胰蛋白酶、皇家紅蝦[22]胰蛋白酶均為50℃，從日本鱸[23]肝胰腺中的2種胰蛋白酶的45℃，明太魚(Theragrachalcogramma)[24]幽門盲囊中的胰蛋白酶為30℃。S75-1在溫度達到65℃時，酶活基本喪失，可能是由于熱失活作用導(dǎo)致的。酶在高溫下失活，可能是由于酶結(jié)構(gòu)在高溫下會部分伸展，破壞酶的作用位點，從而導(dǎo)致酶的活性降低或喪失。

2.3 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1的紫外光譜的影響

在溫度、pH和抑制劑等條件影響下，蛋白質(zhì)溶液的紫外光譜通常會發(fā)生變化。通過紫外光譜的變化情況，可判斷蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境是否發(fā)生了變化以及變化的趨勢[25]，也可以推斷出蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化。因為蛋白質(zhì)分子的生色基團處于不同的微環(huán)境，蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象影響微環(huán)境的性質(zhì)。改變蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象，其所處的微環(huán)境發(fā)生變化，生色基團的紫外吸收光譜隨之改變[26]。

在組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，除含硫氨基酸外，僅有3種氨基酸在230～310 nm間有吸收，分別是色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。當(dāng)紫外光譜在280 nm處發(fā)生藍移或紅移時，說明蛋白質(zhì)中這幾種氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了一定程度的變化。當(dāng)光譜藍移時，芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境疏水性增強，親水性減弱；反之，當(dāng)光譜紅移時，芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境親水性增強，疏水性減弱[27]。

超聲處理和加熱處理對S75-1紫外光譜的影響情況見圖3。從圖3可看出無論是超聲處理還是加熱處理，S75-1的紫外吸光度都出現(xiàn)了不同程度的上升。當(dāng)酶液S75-1經(jīng)過超聲處理后，其紫外吸光值在250～280 nm處的峰位有發(fā)生藍移，從280 nm藍移到274 nm。這說明超聲處理可能使S75-1中芳香族氨基酸的微環(huán)境疏水性增加。當(dāng)酶液經(jīng)過加熱處理后，其紫外吸光值在250～280 nm處的峰位未有較大影響(遷移距離等于1 nm)，峰位沒有明顯變化，說明溫度對絲氨酸蛋白酶S75-1微環(huán)境的影響不大。

2.4 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1的內(nèi)源熒光光譜的影響

外界條件同樣影響蛋白質(zhì)溶液的熒光光譜，通過在不同激發(fā)波長的內(nèi)源熒光變化情況，可判斷蛋白質(zhì)的生色基團微環(huán)境是否發(fā)生了變化以及變化的趨勢[28]。在組成蛋白質(zhì)所有的氨基酸殘基中，Trp、Tyr和Phe均能產(chǎn)生內(nèi)源熒光，三者的熒光發(fā)射峰分別為348、303和282 nm[29]。所以，通常在發(fā)射波長為280和295 nm處能檢測到熒光光譜，但Phe的熒光強度較弱，不容易被檢測到，所以一般認為蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光大部分來源于Trp和Tyr。當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時，熒光全部來源于Trp和Tyr，但是以Trp為主，當(dāng)激發(fā)波長為295 nm時，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光全部來源于Trp[30-31]。

圖3 超聲(A)和加熱(B)處理對絲氨酸蛋白酶S75-1紫外光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic (A) and heat (B) treatment on UV spectra of serine protease S75-1

從圖4可以看出，三疣梭子蟹肝胰腺中S75-1在熒光激發(fā)波長280和295 nm下，超聲和加熱處理都使其熒光強度出現(xiàn)了不同程度的降低，這說明超聲和加熱都能引起S75-1在激發(fā)波長280和295 nm處的熒光猝滅效應(yīng)。

當(dāng)熒光激發(fā)波長為280 nm時，S75-1經(jīng)過超聲處理后，其內(nèi)源熒光峰位發(fā)生了藍移現(xiàn)象(見圖4A)，即從331.2 nm藍移到328.6 nm。經(jīng)過加熱處理后，S75-1內(nèi)源熒光峰位發(fā)生了紅移現(xiàn)象(見圖4B)，即峰位從331.0 nm紅移到343.0 nm。酶液S75-1內(nèi)源熒光峰位發(fā)生藍移，說明超聲處理能使酶的熒光殘基疏水性增強、親水性減弱，由此推測，超聲處理使得熒光殘基微環(huán)境更加聚合，使其更加包埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，從而使其非極性增強，導(dǎo)致熒光光譜藍移，此結(jié)果也與上述在紫外光譜檢測結(jié)果一致[27]。加熱處理卻能使2種酶的內(nèi)源熒光峰位發(fā)生紅移，這說明加熱處理能使酶的熒光殘基親水性增強、疏水性減弱，推測加熱能使絲氨酸蛋白酶熒光殘基處蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加疏松，熒光殘基暴露在外面，極性增加，導(dǎo)致熒光光譜峰位紅移[31]。

當(dāng)熒光激發(fā)波長為295 nm時，超聲處理(見圖4C)后S75-1的內(nèi)源熒光峰位出現(xiàn)輕微遷移現(xiàn)象(遷移距離小于1 nm)。加熱處理(見圖4D)后其內(nèi)源熒光峰位發(fā)生了紅移現(xiàn)象，峰位從331.2 nm紅移到344.0 nm。加熱處理能使其內(nèi)源熒光峰位紅移，這說明加熱處理能使酶的Trp殘基親水性增強、疏水性減弱，同樣推測，加熱能使絲氨酸蛋白酶Trp殘基的微環(huán)境更加疏松延展，導(dǎo)致熒光光譜峰位紅移。

(A、B：激發(fā)波長280 nm；C、D：激發(fā)波長295 nm。A、B: Excitation wavelength 280 nm; C、D: Excitation wavelength 295 nm.)圖4 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1熒光光譜的影響Fig.4 Effect of ultrasonic and heat treatment on fluorescence spectra of serine protease S75-1

2.5 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1同步熒光光譜的影響

同步熒光光譜技術(shù)是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，通過選擇合適波長差(Δλ)，可將在普通熒光光譜上相互重疊的熒光峰分開，具有簡化光譜、窄化譜帶和避免干擾等優(yōu)點，常用來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[32]。當(dāng)Δλ=15 nm時，熒光光譜的紅、藍移反應(yīng)蛋白質(zhì)中Tyr微環(huán)境極性的變化情況；當(dāng)Δλ=60 nm時，反映Trp微環(huán)境極性的變化情況[33]。

如圖5所示，當(dāng)激發(fā)波長和發(fā)射波長之差為15和60 nm時，超聲和加熱處理都使S75-1的熒光強度出現(xiàn)了不同程度的降低，這說明超聲和加熱都能引起酶在激發(fā)波長和發(fā)射波長在波長差15和60 nm處的熒光猝滅效應(yīng)。

當(dāng)Δλ=15 nm時，超聲處理(見圖5A)使S75-1的峰位從292.4 nm藍移到290.8 nm，說明超聲處理使得S75-1的Tyr殘基更加包埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部而使其非極性增強，導(dǎo)致熒光光譜藍移。加熱處理(見圖5B)使其峰位從292.8 nm藍移到284.8 nm，表明加熱處理能使酶的Tyr殘基疏水性增強、親水性減弱。由此推測，加熱能使酶發(fā)光基團Tyr殘基的微環(huán)境更加聚合，導(dǎo)致熒光光譜藍移，但是從激發(fā)波長280和295 nm的紅移來看，加熱對S75-1中Tyr殘基的微環(huán)境的影響小于對Trp殘基微環(huán)境的影響。

在Δλ=60 nm時，S75-1酶液經(jīng)過超聲處理后，其內(nèi)源熒光峰位遷移現(xiàn)象不明顯(遷移距離小于1 nm)(見圖5C)。當(dāng)S75-1酶液經(jīng)過加熱處理后(見圖5D)，酶的內(nèi)源熒光峰位發(fā)生了紅移現(xiàn)象，從278.6 nm紅移到281.4 nm。這與上述在激發(fā)波長295 nm處所得結(jié)論相印證，由此推測，加熱能使S75-1中Trp殘基的微環(huán)境更加疏松延展，導(dǎo)致熒光峰位紅移。

(A、B：Δλ=15 nm；C、D：Δλ=60 nm)圖5 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1的同步熒光光譜的影響Fig.5 Effect of ultrasonic and heat treatment on synchronous fluorescence spectra of serine protease S75-1

2.6 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1降解情況的影響

超聲波和加熱處理對S75-1降解情況的影響(見圖6)。超聲波處理使S75-1發(fā)生降解，酶降解后，原電泳條帶下方呈現(xiàn)一片低分子量條帶。

絲氨酸蛋白酶S75-1在加熱5 min后，42和35 kD左右處的2條電泳條帶均變淺，說明加熱5 min后，大部分的酶已經(jīng)被降解。隨著加熱時間的延長，在分子量25和15 kD左右出現(xiàn)幾條明顯條帶，且蛋白條帶顏色越來越深。

從圖6可看出，超聲和加熱對酶的降解機制不同，超聲對酶的降解可能是無規(guī)則的斷裂酶的肽鍵。Tian等[16]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲處理后的胰蛋白酶用高效液相-質(zhì)譜法檢測出很多片段，此結(jié)果也與本試驗結(jié)果相互印證。而加熱則是高溫使酶內(nèi)部的某個肽鍵處斷裂而呈現(xiàn)出一種規(guī)律性，此結(jié)果與David[19]研究得出的結(jié)論類似。

3 結(jié)論

超聲和加熱處理會對絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)和酶活產(chǎn)生不同程度的影響。就對酶活而言，低功率短時間超聲處理，使酶活有一定程度的上升，反之均能使酶的活性降低。在65 ℃熱處理15 min時，絲氨酸蛋白酶活基本喪失。與超聲處理相比，加熱處理更易控制酶活。就絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)而言，超聲和加熱處理均能導(dǎo)致絲氨酸蛋白酶的構(gòu)象變化。超聲處理能引起絲氨酸蛋白酶芳香族基團更加包埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，使其非極性增強。加熱處理對蛋白酶有熒光猝滅作用，使絲氨酸蛋白酶熒光殘基處蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加疏松，極性增加。超聲和加熱兩種處理方法都能引起絲氨酸蛋白酶的降解，并且兩種處理方法的降解機制不同，加熱降解更具規(guī)律性。

(M：標準蛋白; 1：未處理的絲氨酸蛋白酶S75-1；2：酶超聲處理200 W 30 min；3：酶超聲處理200 W 30 min+400 W 20 min；4：加熱處理30 s；5：加熱處理60 s；6：加熱處理5 min；7：加熱處理10 min。M: standard protein; 1: untreated serine protease S75-1; 2: ultrasonic treatment 200 W 30 min; 3: ultrasonic treatment 200 W 30 min+400 W 20 min; 4: heat treatment 30 s; 5: heat treatment 60 s; 6: heat treatment 5 min; 7: heat treatment 10 min. )

圖6 超聲和加熱處理對絲氨酸蛋白酶S75-1的降解影響
Fig.6 Effect of ultrasonic treatment and heat treatment on degradation of serine protease S75-1