腸道急性移植物抗宿主病黏膜通透性與腸黏膜病理改變的相關(guān)性研究

蔡芳芳 莊 強(qiáng) 朱融和 梁 彬 俞 康 江松福

消化道是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)的重要靶器官，也是重要的aGVHD放大系統(tǒng)［1］。如何早期評(píng)估腸道功能屏障，早期阻斷這一始動(dòng)環(huán)節(jié)，減少aGVHD的發(fā)生顯得至關(guān)重要。目前臨床上仍缺乏安全有效的檢測(cè)手段。本研究采用小鼠異基因骨髓移植模型，研究aGVHD腸道通透性及其嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在為早期腸道aGVHD提供較敏感的檢測(cè)指標(biāo)。

材料與方法

1.aGVHD小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］:SPF級(jí)雌性 BALB/C(H-2d)小鼠，6～8周齡，體重18～22g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自溫州醫(yī)學(xué)院，許可證號(hào):SYXK(浙)2005-0061。隨機(jī)分為單純照射組(對(duì)照組)和aGVHD移植后第7、11和15天組，每組8只。TBI組接受直線加速器全身照射(總劑量:8.0Gy，照射距離:50cm，照射時(shí)間:8min，劑量率:1.0Gy/min)。對(duì)照組只接受TBI照射，與實(shí)驗(yàn)組同步喂養(yǎng)。

2.儀器:直線加速器(VARIAN CL2300C/D，美國(guó));美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng);美國(guó) Agilent INTERFACE 35900E信號(hào)轉(zhuǎn)換器;法國(guó)SEDERE SEDEX75蒸發(fā)光散色檢測(cè)器;NH2色譜柱(Agilent，美國(guó));7500 Real Time PCR System(ABI公司，美國(guó));臺(tái)式高速離心機(jī) (BECKMAN公司，美國(guó))。

3.試劑:乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品和甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，Sigma公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司);異丙醇(色譜純，天津四友試劑公司);甲醇(分析純，天津四友試劑公司);超純水(Millipore公司，法國(guó))。

4.給藥方法及尿樣采集:受試前所有小鼠禁食8～12h，取0.5ml乳果糖/甘露醇混合液(含乳果糖60mg/ml，甘露醇40mg/ml)，用灌胃器插小鼠食管上端緩慢灌注。收集6h尿液，記總量，將尿樣置于-20℃保存，待尿樣收齊后檢測(cè)。分別采集對(duì)照組小鼠和aGVHD后第7、11和15天小鼠的6h尿液。

5.尿樣預(yù)處理:取冰凍貯存的尿液樣品解凍、搖勻，將尿樣離心(12000r/min)30min，以去除尿中的沉淀物。再經(jīng)0.22μm濾膜去蛋白顆粒。用超聲波脫氣20min后上機(jī)分析待檢。

6.色譜條件參考文獻(xiàn)［3］的方法:色譜柱:Agilent NH2色譜柱(4.6mm×250mm×5um)，柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈:水(83∶17)，流速為 1.0ml/min，進(jìn)樣量為 20μl，ELSD 檢測(cè)器漂移管溫度:40℃;載氣壓力:3.0bar;電信號(hào)放大系數(shù):4。

7.腸組織病理改變及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):光鏡下觀察組織學(xué)變化，評(píng)價(jià)小腸aGVHD程度，并進(jìn)行相關(guān)性分析。小腸aGVHD嚴(yán)重程度按Thomas GVHD病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定［4］。0度(0分):腸黏膜絨毛正常。Ⅰ度(1分):腸黏膜隱窩腺體擴(kuò)張，個(gè)別上皮細(xì)胞壞死。Ⅱ度(2分):同Ⅰ度，腸腺壞死脫落。Ⅲ度(3分):同Ⅱ度，灶性黏膜裸露。Ⅳ度(4分):彌漫性黏膜裸露。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取清晰的切片8張，每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)取5個(gè)視野，由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法評(píng)分。

結(jié) 果

1.腸道通透性比較:腸道通透性以乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)表示。腸道aGVHD后7、11和15天組尿中乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)均明顯高于對(duì)照組，分別為0.509±0.353，0.717±0.012，0.762 ±0.014，0.291 ±0.053，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，L/M比值逐漸增高。

2.移植后腸道組織病理變化及aGVHD嚴(yán)重程度評(píng)分:異基因移植組根據(jù)存活期、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、臨床表現(xiàn)及病理檢查等均可在相對(duì)集中的時(shí)間內(nèi)(8～15天)觀察到典型的aGVHD改變。第7、11天可見(jiàn)腸道病理GVHDⅠ～Ⅱ度改變，腸黏膜上皮細(xì)胞輕中度壞死脫落，黏膜下有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。第11～15天可見(jiàn)腸道病理GVHDⅡ～Ⅲ度改變，黏膜上皮壞死脫落，黏膜下層充血水腫，黏膜下層與固有層有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩細(xì)胞有變性壞死，腺體有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);皮膚可見(jiàn)散在的炎細(xì)胞;肺泡壁可見(jiàn)充血、滲出、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。未見(jiàn)明顯的Ⅳ度改變。移植后第7天，即發(fā)現(xiàn)腸道黏膜上皮細(xì)胞有輕度壞死脫落，黏膜下有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，移植后第11天腸道黏膜損傷程度進(jìn)一步加重，腸道aGVHD呈上升趨勢(shì)，第15天時(shí)損傷達(dá)到最重，腸道aGVHD嚴(yán)重程度評(píng)分大幅度上升。aGVHD后7、11和15天組aGVHD嚴(yán)重程度評(píng)分較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，分別為0.810±0.259，1.940 ±0.176，2.750 ±0.267，0.000±0.000。

3.aGVHD各組L/M與腸道aGVHD嚴(yán)重程度相關(guān)性分析:經(jīng) Spearman分析，尿 L/M比值與腸道aGVHD嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(r=0.903，P＜0.01)。隨著腸道通透性的增加，腸道aGVHD嚴(yán)重程度越重。

討 論

減少嚴(yán)重GVHD發(fā)生和降低移植相關(guān)死亡的關(guān)鍵在于預(yù)防GVHD的發(fā)生。消化道是aGVHD重要的靶器官之一，腸道屏障功能障礙、腸內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素移位是導(dǎo)致腸道aGVHD的一個(gè)重要因素，嚴(yán)重影響了HSCT的預(yù)后［5，6］。由于腸黏膜通透性變化可準(zhǔn)確反映腸屏障功能狀態(tài)，對(duì)預(yù)示疾病過(guò)程中轉(zhuǎn)歸具有主要意義［7，8］。所以，臨床上對(duì) aGVHD 患者如能進(jìn)行腸道通透性監(jiān)測(cè)，將對(duì)減少腸源性感染的發(fā)生并及早采取防治對(duì)策，降低病死率有十分重要的作用。

腸黏膜屏障主要由腸黏膜上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成。以乳果糖和甘露醇作為探針能夠檢測(cè)腸通透性的改變。通常情況下，甘露醇分子質(zhì)量小，可經(jīng)跨膜途徑以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式被動(dòng)吸收，而乳果糖分子質(zhì)量大，不能穿過(guò)泡膜和細(xì)胞間緊密連接，只有極少量被吸收，當(dāng)腸黏膜受損時(shí)，高分子乳果糖則可通過(guò)細(xì)胞膜旁徑路被大量吸收，使L/M比值增加，故測(cè)定尿中L/M比值可間接準(zhǔn)確地反映腸通透性改變，廣泛用于腸黏膜通透性的評(píng)估，而通透性改變則可反映腸黏膜的損害程度［9］。莊強(qiáng)等［3］采用 HPLC-ELSD檢測(cè)小鼠尿液中乳果糖和甘露醇含量，具有簡(jiǎn)便、專一靈敏、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，可用于aGVHD小鼠腸道通透性的測(cè)定和監(jiān)測(cè)。本研究通過(guò)建立 aGVHD小鼠模型，采用 HPLC-ELSD檢測(cè)aGVHD組尿乳果糖和甘露醇的排出量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)aGVHD后各組L/M值較對(duì)照組增加，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致。

研究結(jié)果表明，腸道aGVHD后腸黏膜結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能減弱，使細(xì)菌的降解產(chǎn)物如 LPS進(jìn)入血液，引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，是aGVHD致靶器官各種病理?yè)p害的重要原因之一［5，6］。本研究通過(guò)對(duì)腸道通透性與腸道aGVHD嚴(yán)重程度相關(guān)性分析結(jié)果表明，aGVHD后腸黏膜通透性與腸道aGVHD嚴(yán)重程度呈顯著相關(guān)性，即腸道通透性增加，腸道aGVHD嚴(yán)重程度越重。這一結(jié)果提示，腸道通透性與腸道損傷程度有著密切的關(guān)系。aGVHD引起腸道黏膜細(xì)胞損傷、黏膜通透性增加。

檢測(cè)尿中L/M比值變化方法簡(jiǎn)單易行，為無(wú)創(chuàng)傷指標(biāo)，克服了常規(guī)通過(guò)胃腸鏡活檢判斷aGVHD腸道病變嚴(yán)重程度的缺陷，能動(dòng)態(tài)反映腸黏膜屏障功能狀況，在腸道aGVHD的評(píng)估中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。它及時(shí)在早期發(fā)現(xiàn)并判斷腸屏障的受損程度，為降低aGVHD的發(fā)生率和病死率提供了有力的無(wú)創(chuàng)指標(biāo)。

1 Johansson JE，Ekman T.Gut toxicity during hemopoietic stem cell transplantation may predict acute graft-versus-host disease severity in patients［J］.Dig Dis Sci，2007，52(9):2340-2345

2 蔡芳芳，俞康，江松福.小鼠異基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立［J］.溫州醫(yī)學(xué)院報(bào)，2009，39(4):320-324

3 莊強(qiáng)，俞康，江松福.全身照射小鼠模型腸道通透性HPLC-ELSD檢測(cè)方法的建立［J］.溫州醫(yī)學(xué)院報(bào)，2010，40(3):224-228

4 何長(zhǎng)民，石炳毅.器官移植免疫學(xué)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，1995:351-368

5 Ferrara JL，Reddy P.Pathophysiology of graft-versus-host disease［J］.Semin Hematol，2006，43(1):3-10

6 Copelan EA.Hematopoietic stem-cell transplantation［J］.N Engl J Med，2006，354(17):1813-1826

7 Fink MP.Gastrointestinal muosal injury in experimental model of shock，trauma and spesis［J］.Crit Care Med，1991，19(5):627-641

8 Lunn PG，Northrop-Clewes CA，Downes RM.Intestinal permeability，mucosal，and growth fatering in Gambian infants［J］.Lancet，1991，338(8772):907-910

9 Dumas F，Aussel C，Pernet P，et al.Gas chromatograply applied to the lactulose2mannitol intestinal permeability test［J］.J Chromatogr B，1994，654(2):276-281

10 Melichar B，Hyspler R，Dragounová E，et al.Gastrointestinal permeability in ovarian cancer and breast cancer patients treated with paclitaxel and platinum［J］.BMC Cancer，2007，7:155