漢坦病毒與機(jī)體干擾素免疫應(yīng)答

葉偉 白文濤

漢坦病毒與機(jī)體干擾素免疫應(yīng)答

葉偉 白文濤

漢坦病毒屬(hantavirus，HV)是布尼亞病毒科的單負(fù)鏈RNA病毒，其基因組分為L(zhǎng)、M、S 3個(gè)片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣殼蛋白(NP)，病毒主要分為引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)的舊大陸漢坦病毒和引起漢坦病毒心肺綜合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS)的新大陸漢坦病毒。前者主要包括漢坦病毒原型株漢坦病毒(HTNV)、漢城病毒(SEOV)、多布拉伐病毒(DOBV)和普馬拉病毒(PUUV)等，后者主要包括辛諾柏病毒(SNV)、紐約病毒(NY－1V)和安第斯山病毒(ANDV)等。除了這些病毒之外，還有被認(rèn)為是不引起人類明顯疾病的圖拉病毒(TULV)和希望山病毒(PHV)等。

固有免疫是機(jī)體抵抗外來病原體入侵的第一道防線［1］。其中機(jī)體對(duì)病毒的識(shí)別是宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的先決條件病毒感染機(jī)體后，宿主通過一系列模式識(shí)別受體(pathogen recognition receptors，PRRs)來識(shí)別病毒的病原相關(guān)分子模式(pathogen－associated molecular patterns，PAMPs)從而引起干擾素(IFNs)等細(xì)胞因子的分泌，啟動(dòng)下游效應(yīng)分子來抑制病毒的復(fù)制。目前業(yè)已闡明，PRRs主要包括Toll－樣受體(Toll like receptor，TLRs)、視黃醛酸誘導(dǎo)基因I(RIG－I)樣RNA解旋酶(retinoic acid－inducible gene I－like RNA helicases，RLHs)和棒狀受體(NOD－like receptors，NLRs)等。同時(shí)，病原體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，也發(fā)展出了種類多樣的逃避宿主固有免疫的手段和方法來達(dá)到感染復(fù)制的目的。本文擬就漢坦病毒與固有免疫的干擾素系統(tǒng)之間的關(guān)系做一簡(jiǎn)要綜述。

一、固有免疫的干擾素系統(tǒng)

IFNs是自分泌或旁分泌的具有多種功能的蛋白質(zhì)。主要分為3種類型:Ⅰ型干擾素(IFNα，IFNβ)、Ⅱ型(IFNγ)和Ⅲ型(IFNλ1，IFNλ2和IFNλ3)。其中Ⅰ型與Ⅲ型IFNs可在機(jī)體絕大多數(shù)組織與細(xì)胞中產(chǎn)生，而Ⅱ型IFN主要由包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和肥大細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生［2，3］。IFN與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，激活Jak/Stat信號(hào)通路從而啟動(dòng)三聚的IFN刺激應(yīng)答因子(ISRE3)與信號(hào)傳遞和轉(zhuǎn)錄激活分子1(Stat1)、Stat2和IFN應(yīng)答因子9(IRF9)。隨后ISRF3入核并結(jié)合位于大部分IFN誘導(dǎo)基因(ISGs)啟動(dòng)子區(qū)域上特異的IFN刺激反應(yīng)元件(ISRE)，從而發(fā)揮其免疫效應(yīng)［4，5］。

RNA病毒具有眾多可被宿主PRRs所識(shí)別的PAMPs，TLR與RIG－I是目前已闡明的識(shí)別病毒PAMPs的受體。目前為止，包膜糖蛋白、dsRNA、5'端具有三磷酸的單鏈RNA、非甲基化的CpG DNA均被確定可與特異的PRRs反應(yīng)［4］。PRRs參與識(shí)別后最終激活TNF受體相關(guān)因子3(TRAF3)、TRAF家族成員相關(guān)NF－κB激活蛋白結(jié)合激酶1(TBK1)和IκB－激酶ε(IKKε)等，并進(jìn)而激活I(lǐng)RF3/IRF7［9］，最終引起下游干擾素基因的表達(dá)。

二、漢坦病毒與干擾素系統(tǒng)的相互作用

1．固有免疫識(shí)別漢坦病毒的機(jī)制:TRAF3已被證實(shí)參與了Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的PRR信號(hào)通路［5］。A549細(xì)胞上TLR3正常表達(dá)水平比較低，IFN刺激后，A549并不能誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答，而HTNV感染后的A549可以上調(diào)TLR3，使得TLR3下游抗病毒免疫應(yīng)答成為可能［6］。TLR3主要表達(dá)在胞質(zhì)的內(nèi)體(endosome)中或細(xì)胞表面，通過其胞外區(qū)識(shí)別特異的PAMPs——dsRNA［7］。HTNV對(duì)TLR3的募集可導(dǎo)致抗病毒和炎癥應(yīng)答。HTNV的持續(xù)感染很可能是固有免疫應(yīng)答的滯后和炎癥反應(yīng)的持續(xù)。此外，多種RNA病毒，例如流感病毒A、西尼羅河病毒、白蛉病毒等被發(fā)現(xiàn)可以通過TLR3來調(diào)節(jié)固有免疫的炎癥應(yīng)答，使炎癥因子的表達(dá)增多。所以，TLR3的持續(xù)激活可能是炎癥因子過量表達(dá)的誘因，這也可能病毒致病的一個(gè)因素。

利用不含有RIG－I基因的HuH 7．5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHV誘導(dǎo)早期固有免疫應(yīng)答并不依賴RIG－I［6］。但最近Günther Sch?nrich的研究第一次發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)錄HTNV N RNA和HTNV N ORF(開放讀碼框)誘導(dǎo)了RIG－I信號(hào)，表明RIG－I可以識(shí)別漢坦病毒的復(fù)制［8］。但HTNV RNA激活RIG－I的機(jī)制尚不清楚，該研究組的研究也與前期研究相似，即HTNV基因組RNA并不顯著激活RIG－I［9］。而HTNV的cRNA是否是RIG－I的激活因子還需要進(jìn)一步研究。

2．漢坦病毒對(duì)干擾素的誘導(dǎo):體外漢坦病毒感染實(shí)驗(yàn)和中和試驗(yàn)已證實(shí)Ⅰ型干擾素(IFNα/β)是固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中心并可限制漢坦病毒的感染［10］。近期研究表明Ⅲ型干擾素和Ⅰ型干擾素參與了漢坦病毒在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)的固有抗病毒應(yīng)答。PUUV感染的HFRS病人的急性期與恢復(fù)期血清相比，Ⅲ型干擾素水平有所降低。與PHV相比，在A549與HuH7細(xì)胞中，致病性的PUUV誘導(dǎo)了更低水平的IFNγ［11］。

致病性與非致病性漢坦病毒誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答的機(jī)制在多種細(xì)胞系中是保守的。有的研究組報(bào)道在A549，HuH7中觀察到了HTNV、PHV和ANDV感染產(chǎn)生的抗病毒與炎癥應(yīng)答，但也有研究報(bào)道稱這些細(xì)胞系對(duì)SNV感染沒有相關(guān)應(yīng)答［11～13］。此外，敲除TRAF3與TLR3基因的A549細(xì)胞失去了對(duì)HTNV感染誘導(dǎo)黏病毒抗性蛋白A(MxA)的能力［6］。Vero E6細(xì)胞是Ⅰ型干擾素基因缺失的細(xì)胞系，早期觀點(diǎn)是Vero E6對(duì)病毒感染并不能產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答。但最近有報(bào)道稱，SNV、ANDV和PHV感染Vero E6后，可以檢測(cè)到Ⅲ型干擾素的分泌［13］。此外，據(jù)Prescott及其同事報(bào)道稱，由Vero E6擴(kuò)增出的病毒儲(chǔ)存液會(huì)含有不同量的IFNλ，這是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，但這也說明了用Vero E6擴(kuò)增出的病毒所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論可能會(huì)有不同程度的偏差，或需要重新評(píng)價(jià)［13］。

mRNA表達(dá)水平分析顯示，原代內(nèi)皮細(xì)胞在PHV感染后誘導(dǎo)了高水平的MxA。但在NY－1V與HTNV感染中未發(fā)現(xiàn)MxA水平升高。作者推測(cè)可能是這些漢坦病毒抑制了早期IFN的應(yīng)答。類似的研究結(jié)果也在TULV和HTNV間發(fā)現(xiàn)。內(nèi)皮細(xì)胞并不具有IFNλ的功能性受體，所以來源于Vero E6細(xì)胞的病毒一般不會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的ISGs的表達(dá)［13］。

多個(gè)研究組研究顯示，重組Ⅰ型與Ⅱ型干擾素的預(yù)處理可有效抑制漢坦病毒的復(fù)制［14］。但感染若已經(jīng)建立，則干擾素對(duì)病毒復(fù)制的干擾作用則顯著降低［10，15］。而其中的一個(gè)原因是，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的高水平的病毒編碼的產(chǎn)物表達(dá)水平大大超過固有免疫系統(tǒng)效應(yīng)分子所能處理的量。此外，重組的MxA預(yù)處理可以在Vero E6細(xì)胞中阻止?jié)h坦病毒復(fù)制，但其機(jī)制尚不明了。其他病毒中，如正黏病毒科的Togoto病毒和與漢坦病毒同屬布尼亞病毒科的La Crosse病毒的核蛋白可與MxA相互作用，且這種相互作用被認(rèn)為是MxA通過消除病毒復(fù)制所需的NP來起作用，類似的相互作用可能也在漢坦病毒感染的細(xì)胞中存在［16］。為逃避MxA的效應(yīng)，一些漢坦病毒可使MxA失去功能［11］。體內(nèi)與體外的研究提示除MxA外，其他IFN誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)分子也可能參與了控制漢坦病毒感染的過程［17］。上述研究都顯示，在病毒產(chǎn)物大量增多之前誘導(dǎo)出合適的固有免疫應(yīng)答有利于控制病毒的感染。

3．漢坦病毒相關(guān)逃逸機(jī)制:為建立感染，病毒發(fā)展出了復(fù)雜和多重的策略來逃避或阻斷宿主的抗病毒IFN系統(tǒng)。目前的研究顯示ANDV、HTNV和PHV損害了與Ⅰ型干擾素激活的Stat1和Stat2。Stat1活化水平的降低并在胞質(zhì)內(nèi)的停滯也在外源表達(dá)ANDV的糖蛋白的細(xì)胞中觀察到［15，18］。但ANDV與PHV都對(duì)IFN的下游通路具有類似的拮抗作用，故單獨(dú)靶向激活Stat1/Stat2很難解釋致病與非致病漢坦病毒固有免疫應(yīng)答水平的不同的原因［18］。

核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，是IFN的增強(qiáng)子復(fù)合體的一個(gè)成分，并且是IFN高水平表達(dá)的必要成分［19］。最近有研究發(fā)現(xiàn)HTNV的核蛋白可以抑制TNF－α誘導(dǎo)的NF－κB的活化。外源表達(dá)核蛋白(NP)即可以阻斷NF－κB p65亞基轉(zhuǎn)運(yùn)入核。與此對(duì)應(yīng)，有報(bào)道稱，NP與可控制蛋白穿越核孔的importin α蛋白有直接相互作用［20］。在SEOV、DOBV中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果;而ANDV、SNV和PUUV中尚未見報(bào)道［21］。這些結(jié)果均表明了漢坦病毒發(fā)展出了多種規(guī)避固有免疫的策略。

PHV、PUUV和ANDV的基因組S片段還具有第2個(gè)開放讀碼框，可能編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)PUUV感染的Vero E6中有NSs－ORF的表達(dá)。且報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了PUUV的NSs－ORF可拮抗干擾素［22，23］。但NSs－ORF在致病性與非致病性漢坦病毒中都有發(fā)現(xiàn)，所以，NSs－ORF可能并不是漢坦病毒在人類中致病的決定因素。

Spiropoulou及其同事最早在1993年在美國(guó)四角區(qū)暴發(fā)的HCPS時(shí)分離出了HCPS的病原體。他們近期研究發(fā)現(xiàn)IRF3激活前，對(duì)ANDV和PHV感染的細(xì)胞有不同的影響［18］。與此相應(yīng)，外源表達(dá)NY－1V的Gn胞質(zhì)段尾部可以通過破壞TRAF3/TBK1復(fù)合體來阻斷IRF3的激活。這與感染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TRAF3/TBK1的狀態(tài)不穩(wěn)定的結(jié)果類似。但表達(dá)PHV Gn胞質(zhì)尾段或和PHV感染實(shí)驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)TRAF3/TBK1復(fù)合體的分解［10，24］。

NY－1V Gn胞質(zhì)尾段只有在蛋白酶抑制劑MG132存在時(shí)才可檢測(cè)到，而MG132存在時(shí)也增加了ANDV和HTNV Gn胞質(zhì)區(qū)的穩(wěn)定性。與此相對(duì)，PHV的Gn胞質(zhì)尾段在MG132存在與否時(shí)未見顯著差別。此研究說明，致病性漢坦病毒的Gn可能是阻滯IFN應(yīng)答的一個(gè)重要因素。但Gn胞質(zhì)尾段可能并不是降低IFN應(yīng)答的決定性因素。通過PHV和PUUV的體外基因重排，命名為PHPUV的病毒含有PUUV的M片段和PHV的S和L片段。這種表型的漢坦病毒與PUUV和PHV感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，所表現(xiàn)的IFN系統(tǒng)的應(yīng)答(包括MxA和IFN mRNA)都與PHV類似而與PUUV相反［11］。這說明這兩種病毒對(duì)固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)是由S與L片段決定的。早期研究表明非致病的PHV利用整合素β1而致病性PUUV利用β3作為受體而入胞的。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)說明了M片段編碼的嚢膜糖蛋白在調(diào)節(jié)病毒特異的固有免疫應(yīng)答上貢獻(xiàn)甚微。這項(xiàng)研究的另一意義是，PHPUV感染可產(chǎn)生針對(duì)PUUV的中和抗體，而病毒本身又類似PHV對(duì)人不致病，所以有可能作為一種減毒活疫苗來使用。但其他類型的重組可能會(huì)造成新的疾病流行，有報(bào)道稱Bunyamwera病毒與Batai病毒在體內(nèi)的重組造成了嚴(yán)重的發(fā)熱病的暴發(fā)。所以體內(nèi)重排的危險(xiǎn)因素也是應(yīng)用重組病毒所要認(rèn)真考慮的問題。

三、總結(jié)與展望

漢坦病毒在其自然宿主中是終身隱性感染，故各種病毒都有規(guī)避宿主免疫應(yīng)答的成熟策略。目前已經(jīng)確定RIG－I可識(shí)別漢坦病毒的復(fù)制信號(hào)，漢坦病毒可在被感染細(xì)胞中募集TLR3，多種漢坦病毒可以逃避MxA途徑和抑制NF－κB啟動(dòng)下游信號(hào)，且多種漢坦病毒的Gn胞質(zhì)尾段可以阻斷IRF3的激活等等。鑒于固有免疫在機(jī)體抗病毒感染中的重要作用，明確漢坦病毒規(guī)避IFN系統(tǒng)的不同機(jī)制是確切闡明漢坦病毒致病機(jī)制的首先要解決的問題。

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(收稿:2011－11－15)

(修回:2011－11－18)

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