拉曼光譜法在假藥快檢中的研究進(jìn)展

柳 艷，尹利輝，陸 峰(.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，上海00433;.中國藥品生物制品檢定所，北京00050)

化學(xué)藥品的假冒偽劣現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，假藥的存在不僅嚴(yán)重影響了人們的用藥安全和有效，而且干擾了正常的商業(yè)與社會(huì)秩序。假藥的預(yù)防與打擊在一定程度上依賴于分析檢測技術(shù)的能力，要求除了核心的準(zhǔn)確性(即很低比例的漏判率和誤判率)以外，還包括結(jié)構(gòu)確證能力、快速、簡便、高通量、經(jīng)濟(jì)性等多個(gè)綜合指標(biāo)［1］。目前對假藥的快速檢測技術(shù)主要有化學(xué)法、色譜法、光譜法等。光譜法具有快速、簡便、高通量、經(jīng)濟(jì)等多個(gè)指標(biāo)上的天然優(yōu)勢，因此在打假領(lǐng)域占有一席之地。

拉曼光譜法(儀)在假藥快檢領(lǐng)域獨(dú)具以下優(yōu)勢:①拉曼散射的穿透力強(qiáng)，可以透過玻璃、塑料等透明的藥品包裝或容器，因此可以不破壞包裝，無需樣品前處理，尤其適合各種無損快速檢測，包括對有毒、違禁藥品的無接觸檢測;② 拉曼光譜分析的需樣量少，且由于水的拉曼效應(yīng)很弱，拉曼光譜對含水體系，或少量藥品分析很有優(yōu)勢;③ 拉曼光譜技術(shù)容易獲得400 cm－1以下的光譜信息，有助于無機(jī)化合物的鑒定與表征，這一點(diǎn)對無機(jī)輔料冒充藥品、品牌仿冒等的檢測尤其關(guān)鍵;④采用光纖探頭可對樣品進(jìn)行原位、無損分析，加上便攜式甚至手持式拉曼光譜儀的相繼誕生，更以其輕便、價(jià)廉等諸多優(yōu)勢，在假藥快檢方面比車載的近紅外光譜儀更勝一籌。

近年來，拉曼光譜儀硬件和軟件兩方面都獲得了很大改進(jìn)。硬件方面，光譜采樣技術(shù)發(fā)生了許多根本性的變革，包括表面增強(qiáng)拉曼光譜、激光拉曼探針、空間偏置拉曼光譜、光纖技術(shù)等，這些技術(shù)既提高了拉曼光譜儀的效率和靈敏度，也給儀器采樣帶來了更多的便利和優(yōu)勢。軟件方面，儀器公司開發(fā)了適合不同用戶的界面友好軟件，提供了很多數(shù)據(jù)處理方法，并將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法糅合其中，為用戶計(jì)算和處理光譜降低了門檻。在閱讀了大量拉曼光譜法在假藥快檢方面的研究報(bào)道后，作者對拉曼光譜獲得了較深入的認(rèn)識并在本文中對儀器軟件方面包括光譜預(yù)處理方法、鑒別與定性分析方法的進(jìn)展，以及在假藥快檢中的應(yīng)用作一綜述。

1 光譜預(yù)處理

拉曼光譜的質(zhì)量將直接影響物質(zhì)分析的結(jié)果。拉曼光譜儀器本身產(chǎn)生的隨機(jī)噪聲和干擾物質(zhì)發(fā)射的熒光背景的存在，將嚴(yán)重干擾分析。消除這些干擾因素的方法主要有物理方法(如改變激發(fā)光波長、光致漂白)和信息處理方法(如小波變換、導(dǎo)數(shù)和多項(xiàng)式擬合)等。

目前抑制熒光干擾廣泛采用的策略之一是選擇樣品沒有熒光吸收的波長來激發(fā)，如Ricci等［2］采用近紅外波長(1 064 nm)的激光作為激發(fā)光源可使拉曼光譜的熒光顯著減弱。但該方法并不是一直有效，有些樣品即使采用785 nm波長甚至1 064 nm波長的激光激發(fā)后，仍避免不了較高的熒光干擾。此外，也可以通過光致漂白［3］的作用來降低或消除熒光的干擾，從而獲得很好的拉曼光譜指紋圖譜對物質(zhì)進(jìn)行鑒別。光致漂白是通過降解高吸收物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，但對液體樣品作用并不明顯。

小波分析法是目前拉曼光譜去噪的主要方法。小波變換具有低熵性、多分辨率、去相關(guān)性、基函數(shù)選擇靈活性等特點(diǎn)，從而能在有效消除噪聲的同時(shí)更好地保留有用信息。如陳晨等［4］使用基函數(shù)為bior 2.2小波、Rigrsure方式確定閾值、軟閾值法的小波變換對拉曼信號進(jìn)行處理，去噪效果較好。但閾值法小波變換一般只適用于信噪比高的情況。郭皞巖等［5］采用一種自適應(yīng)小波閾值函數(shù)濾噪法和平移不變量小波濾噪的方法，并分別與傳統(tǒng)的平均算法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對信號與噪音的有效分離。采用小波閾值法對變形信號進(jìn)行處理時(shí)，大多數(shù)會(huì)產(chǎn)生震蕩或呈折線偽吉布斯現(xiàn)象。針對此情況，文鴻雁等［6］采用了非線性小波變換閾值法去噪修勻算法，改進(jìn)效果明顯。但小波變換也具有一定的不適應(yīng)性，如小波基函數(shù)很多，目前往往是通過經(jīng)驗(yàn)或不斷地試驗(yàn)，將不同的分析結(jié)果進(jìn)行對照分析來選擇小波函數(shù);采用不同的小波函數(shù)進(jìn)行分解，得到的結(jié)果可能相差很大;小波閾值的不同選擇和分階級數(shù)的確定也具有較大的自主性等等。

導(dǎo)數(shù)法是另一種簡便快速的光譜預(yù)處理方法。翁欣欣［7］、Veij等［8］均采用導(dǎo)數(shù)法對拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理。但該方法可使光譜峰形發(fā)生改變，并且信噪比隨著求導(dǎo)階數(shù)增大而急劇降低。多項(xiàng)式擬合改進(jìn)后也可以用于基線漂移的校正，能有效降低甚至消除熒光的干擾［9］。

2 定性與鑒別法

2.1 直觀判別法 由于拉曼光譜信息豐富、特征性強(qiáng)，幾乎所有的物質(zhì)都有其特征的拉曼光譜圖，故可以根據(jù)光譜圖中特征峰的有無、峰形、峰位和峰強(qiáng)等的異同，對藥品中主成分和輔料進(jìn)行直接判別。Ricci等［10］將假青蒿琥酯樣品的拉曼圖譜與淀粉(478、946 cm－1)、乙酰氨基酚(405、649、795、858、1 235 cm－1)及碳酸鈣(1 048 cm－1)特征信息進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其含有這些成分，有些甚至包含有安乃近的特征信息(1 000、1 355、1 598、1 632、1 666 cm－1)。曹玲等［11］采集苯甲酸、水楊酸枸櫞酸、乳酸、山梨酸、甲酸乙酯，乙酸乙酯、枸櫞酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、EDTA鹽、依地酸鈣鈉的拉曼光譜，并對拉曼光譜峰進(jìn)行指認(rèn)，可用于羧酸類及其衍生物藥用輔料的鑒別。

該方法直觀、簡單，對于拉曼光譜特征性強(qiáng)的物質(zhì)的鑒別具有很大的優(yōu)勢，由于藥品中其他干擾成分及熒光的干擾，可能使待測組分特征信息發(fā)生掩蓋或掩埋，此時(shí)，直觀判別法受到了很大的限制?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)的方法與拉曼光譜相結(jié)合對物質(zhì)進(jìn)行鑒別和定性分析成為了科研工作者研究的重點(diǎn)。常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法分為無監(jiān)督的模式識別和有監(jiān)督的模式識別。

2.2 無監(jiān)督的模式識別法 聚類分析法是研究“物以類聚”的一種多元統(tǒng)計(jì)方法，即如何使相似的樣本聚在一起，從而達(dá)到分類的目的。主成分分析(PCA)是一種將多個(gè)變量(指標(biāo))通過線性變換降維成少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量(指標(biāo))的統(tǒng)計(jì)方法，從而可以減少計(jì)算量和分析問題的復(fù)雜性，主要用于降維。這兩種方法常相結(jié)合用于物質(zhì)的鑒別。Veij等［8］采用PCA結(jié)合k-means法和歐氏距離聚類分析法，對真假偉哥的拉曼光譜進(jìn)行判別。但PCA只能處理線性問題，有時(shí)降維的效果并不明顯。為了解決這種問題，翁欣欣等［7］采用KPCA-聚類分析法，對不同種類的降糖藥片進(jìn)行了快速、簡便的鑒別，采用KPCA提取特征變量的聚類分析結(jié)果比采用PCA后進(jìn)行聚類分析的效果好。

2.3 有監(jiān)督的模式識別法

2.3.1 相似度及距離法 相似度法，通過計(jì)算待測樣品與譜圖庫中的每一類平均光譜的夾角余弦來判斷其相似性。距離法有不同種方法，如歐氏距離和馬氏距離法等。

劉暢等［12］采用OPUS自帶的quick identify test功能計(jì)算待測樣品與主要成分對照品的歐式距離，基本上可以將6種降糖藥和12種輔料正確區(qū)分。范賢松等［13］通過建立多潘立酮片真藥藥品的譜圖庫，將待測樣品與譜圖庫中真藥藥品譜圖進(jìn)行拉曼光譜相似度分析，可將5個(gè)批號的多潘立酮片真藥和9個(gè)批號的多潘立酮片假藥進(jìn)行較好地鑒別。

2.3.2 判別分析法 判別分析是指通過預(yù)先設(shè)立的判別準(zhǔn)則和建立已知分類的判別函數(shù)，將未知分類的個(gè)體觀測值代入相應(yīng)的變量，再根據(jù)判別準(zhǔn)則(如函數(shù)值大于某值)判斷未知分類的個(gè)體應(yīng)屬于已知分類中哪一類的一種方法［14］，最常用的方法有Fisher判別法和Bayes判別法等。柳艷等［15］采用Fisher線性判別、Bayes多類逐步判別法對降糖類樣品進(jìn)行分析，獲得較理想的結(jié)果。

2.3.3 PLS和SMICA法 在對假藥的快速檢測中，采集大規(guī)模樣品光譜并建立光譜分析模型(以下簡稱“建?！?的方法是最常用的光譜分析手段之一。常用的方法有偏最小二乘法(PLS)、SIMCA法等。Been等［16］采用PLS-DA法建立真假藥品的模型，對待測樣品進(jìn)行判別。SIMCA是一種建立在主成分分析基礎(chǔ)上的有監(jiān)督模式識別方法，其基本思路是先利用主成分分析的顯示結(jié)果得到一個(gè)樣本分類的基本印象，然后分別對各類樣本建立相應(yīng)的類模型。Sacré等［17］采用該方法可以將28個(gè)假偉哥樣品與8個(gè)真?zhèn)ジ缢幤愤M(jìn)行很好地判別。

2.3.4 非線性方法 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)是一個(gè)高度復(fù)雜的非線性的動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)，具有大規(guī)模并行、分布式存儲(chǔ)、處理、自組織、自適應(yīng)和自學(xué)習(xí)的能力?？捎糜诜诸惖纳窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)主要有徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、反BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，支持向量機(jī)等。Been等［16］采用概率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和反BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對真假藥品進(jìn)行鑒別。柳艷等［15］采用徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立降糖類樣品的模型，對其進(jìn)行分類判別。

上述模式識別法在模型建成后的運(yùn)用中具有簡便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、方法穩(wěn)健等優(yōu)勢，因此已成為光譜分析法的標(biāo)準(zhǔn)模式。但在藥品快檢領(lǐng)域，當(dāng)陰性樣品無法得到，與待測樣品性質(zhì)相近的樣品無法得到，或得到的樣品不足以代表實(shí)際樣品時(shí)，有時(shí)就很難甚至無法建立模型，此時(shí)模式識別法就顯得捉襟見肘了。

2.4 無模型判別法 為了彌補(bǔ)某些情況下無法或很難建立模型的缺陷，陸峰等［18］提出了無模型分析的策略。無模型分析方法既不需要同質(zhì)樣品、陰性樣品或模擬樣品，也不經(jīng)歷建立、驗(yàn)證模型的過程，僅利用待測樣品自身的單張光譜信息，經(jīng)過數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)解析，對樣品中可能存在的成分進(jìn)行定性和定量分析。該類方法(包括局部直線篩選法、褶合曲線搜索法等)最初應(yīng)用于中藥摻雜樣品的紅外光譜分析并取得了良好的結(jié)果，目前正在移植到假藥的拉曼光譜分析。

局部直線篩選法(LSLS)是以光譜上每3個(gè)連續(xù)點(diǎn)組成一個(gè)譜段窗口，從樣品光譜信息中扣除一定比例的摻雜物質(zhì)信息后，篩選各個(gè)局部譜段上的扣除比例的密集區(qū)域。密集區(qū)域所對應(yīng)的扣除比例，即含量因子區(qū)間，也即摻雜物質(zhì)的相對摻雜含量［19］。朱學(xué)義、陸峰等將LSLS法改進(jìn)［20］并運(yùn)用到打擊假藥的領(lǐng)域中。該方法采用了小波濾噪、插值等前處理手段，引進(jìn)了關(guān)于濃度的含量區(qū)間校正，與PCA相結(jié)合，對31個(gè)降糖類藥片和對應(yīng)的132個(gè)陰性樣品進(jìn)行計(jì)算，準(zhǔn)確率達(dá)到95.3%。羅婭等［21］采用改進(jìn)的局部直線篩選法對降糖藥及輔料進(jìn)行快速鑒別，其靈敏度達(dá)到 100.00%，專屬性達(dá)到94.44%，準(zhǔn)確度達(dá)到96.36%。宋清等［22］對三種無模型的方法進(jìn)行了比較，也再次證明了LSLS的方法也適用于藥品拉曼光譜的快速鑒別。

3 拉曼光譜法在假藥快速檢測中的應(yīng)用

拉曼光譜在假藥分析中的應(yīng)用研究報(bào)道日漸增多，且主要集中在降糖、抗瘧、降脂、壯陽等藥品的快速檢測。

曹玲等［23］采用顯微共聚焦拉曼光譜法，使樣品在顯微鏡下微區(qū)成像，逐點(diǎn)選擇不同的點(diǎn)采集拉曼光譜圖，并與降糖類對照品光譜圖(二甲雙胍、苯乙雙胍、格列美脲、格列齊特)進(jìn)行比對分析，檢出中藥中非法添加鹽酸二甲雙胍。Ricci、Veij等［24，25］采用拉曼光譜技術(shù)對真假青蒿素酯藥片進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有些假藥不含有主要成分青蒿琥酯，而僅含有淀粉、對乙酰氨基酚、滑石粉等。Peindera等［26］采用PLS-DA法對真假立普妥進(jìn)行鑒別，可以將其進(jìn)行區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)假藥中含有的是洛伐他汀成分。王玉等［27］采用顯微共聚焦拉曼光譜法檢測出不同的壯陽類中藥中非法添加PDE5抑制劑西地那非及其同系物他達(dá)那非。對于壯陽藥，Trefi［28］、Veij［8，25］、Sacré等［29］對真假西力士、偉哥樣品也進(jìn)行了鑒別。

隨著分析技術(shù)和手段的提高，也對藥物的鑒別提出了更高的要求，不僅需要將真假藥品進(jìn)行區(qū)分開來，還要根據(jù)假藥的化學(xué)組成對其進(jìn)行分類。Dégardin等［30］采用兩步法對假藥進(jìn)行鑒別，第一步采用非線性判別法、支持向量機(jī)(SVM)對31種真藥、假藥的拉曼光譜進(jìn)行判別。對判定為假藥的樣品進(jìn)行第二步，根據(jù)已知假藥的分類情況，采用PCA法和相關(guān)距離法對假藥樣品進(jìn)行化學(xué)成分分類。Roggo等［31］采用此兩步判別分析，對固體制劑進(jìn)行判別，第一步對25個(gè)不同產(chǎn)品系列進(jìn)行系列上的判別，第二步對其配方進(jìn)行分析，經(jīng)分析25個(gè)產(chǎn)品系列含有44個(gè)配方。Been等［16］采用PCA降維后，選取前3個(gè)主成分計(jì)算待測樣品與譜圖庫樣品的距離，根據(jù)設(shè)定的閾值，篩選出部分符合條件的樣品。接著計(jì)算其全譜間的距離，篩選出最佳的匹配結(jié)果，從而判別待測樣品是否屬于已有類別或?yàn)樾碌念悇e。

4 小結(jié)與展望

拉曼光譜因具有無需樣品預(yù)處理、樣品用量少、無損等優(yōu)點(diǎn)，加之CCD檢測器、光纖探針采樣以及便攜式拉曼光譜儀的出現(xiàn)，伴隨著多種化學(xué)模式判別法及無模型分析法的改進(jìn)和發(fā)展，使其在假藥快檢中具有很好的應(yīng)用前景。

但另一方面，隨著對假藥打擊力度的加大，假冒偽劣藥品也日趨復(fù)雜，有些“高科技”假藥甚至能通過藥典中該品種所有指標(biāo)的檢測，因此需要研究新的相關(guān)對策。同時(shí)，現(xiàn)有方法確實(shí)還存在某些缺陷，如模式識別法建立分析模型的過程過于繁瑣費(fèi)時(shí);無模型分析法在提高結(jié)果的準(zhǔn)確性、方法穩(wěn)健性等方面還需要解決一些瓶頸問題;光譜的預(yù)處理方法還需要進(jìn)一步的完善等等。因此，應(yīng)根據(jù)假藥快檢的特點(diǎn)、難點(diǎn)，不拘泥于經(jīng)驗(yàn)陳規(guī)，研制或配置適用的便攜式拉曼光譜儀，因地制宜地選擇采樣與分析方法，再配備專門的、易用的綜合判別分析系統(tǒng)軟件與一整套完整的解決方案，真正為假藥快檢提供一種有效的技術(shù)支撐手段。

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