低氧誘導(dǎo)因子1α在骨損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展

陳小丹，何家才

(安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，合肥230032)

腫瘤的手術(shù)切除、交通傷、感染或其他原因?qū)е碌墓侨睋p，給患者帶來結(jié)構(gòu)和功能上的影響。骨組織含血量很大，占心排血量的5%～20%。血液可為骨提供氧氣、營養(yǎng)、礦物質(zhì)、可溶性因子、不同類型的細(xì)胞和移走代謝產(chǎn)物，從而維持生長發(fā)育。損傷后，血流中斷或減少而導(dǎo)致局部缺氧。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)及其目標(biāo)基因能夠調(diào)控骨系細(xì)胞、誘發(fā)長入新血管，從而發(fā)揮其在骨缺損修復(fù)中的促進(jìn)作用［4-5］。

1 HIF-1α的生物學(xué)特點(diǎn)

1992 年Semenza等［1］在研究低氧下誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)基因轉(zhuǎn)錄的低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子的特點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)了HIF。低氧條件下，它能激活數(shù)百個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。

HIF 由 HIF-α(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和 HIF-β組成，這兩個(gè)亞單位都是堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。HIF-1是目前研究最為透徹的HIF家族中的一種亞型，由HIF-1α和HIF-1β組成。HIF-1α在常氧下很快降解，但低氧時(shí)穩(wěn)定，是相對分子質(zhì)量為120×103的蛋白質(zhì)為功能性調(diào)節(jié)亞基，由826個(gè)氨基酸組成。HIF-1的穩(wěn)定性及其反式激活作用的調(diào)節(jié)都是通過轉(zhuǎn)錄后修飾來控制，如羥基化、乙?；?、磷酸化、亞硝基化修飾。HIF-1α包含:①PAS(PER-ARNT-SIM)、HLH 域是 HIF-α 和HIF-β結(jié)合成有活性的HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也是介導(dǎo)HIF-1與目標(biāo)基因上的低氧反應(yīng)元件結(jié)合的部位。②氧依賴降解域參與常氧下細(xì)胞內(nèi)HIF的降解和低氧下的穩(wěn)定性和活性［2］。常氧下，位于此區(qū)域的402和564的脯氨酸在脯氨酸羥化酶［3］以及氧、鐵、2-酮戊二酸的輔助因子的共激活下羥基化，位于532的賴氨酸乙酰化后，均能為腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，VHL)識別并可與HIF-1結(jié)合，之后與E3泛素連接酶結(jié)合而形成脯氨酸-VHL-E3復(fù)合體，最后被蛋白酶體降解。低氧下，一些中間代謝產(chǎn)物或鐵抑制脯氨酰羥化酶的活性，從而使HIF-1α表達(dá)穩(wěn)定，并移入細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合成HIF-1異源二聚體。③C末端轉(zhuǎn)錄激活域(C-terminal activation domain，C-TAD)和N末端轉(zhuǎn)錄激活域(N-terminal activation domain，N-TAD)是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)調(diào)節(jié)HIF的轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α的N-TAD和C-TAD受不同機(jī)制調(diào)節(jié)。C-TAD為 HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄激活所必需，而N-TAD在功能上似乎不是必要的。常氧下，位于C-TAD上的803位天冬氨酸被天冬氨酸羥化酶FIH-1羥基化，限制了HIF與p300/CBP的結(jié)合，從而阻礙HIF-1α的降解，兩區(qū)域之間是結(jié)構(gòu)抑制域，對轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域有負(fù)調(diào)控作用。④核定位信號序列是低氧條件下調(diào)節(jié)HIF-1α轉(zhuǎn)移入核的特殊堿基序列。

2 HIF-1α對血管生成的調(diào)控

HIF-1α是啟動血管形成的核心調(diào)控因子，通過調(diào)控靶基因參與血管形成，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與血管生成素2、整合素共同作用，形成血管芽，隨后形成血管腔;調(diào)控一氧化氮合酶2、內(nèi)皮素1等控制血管的緊張度;誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶原活化因子受體和抑制子等參與基質(zhì)代謝和血管的成熟;EPO促進(jìn)紅細(xì)胞生成、增加微血管的密度。然而，HIF-1α對VEGF和EPO的調(diào)控最為重要。VEGF與VEGF受體1、VEGF受體2結(jié)合后能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，向低氧和乏血管區(qū)遷移，降解細(xì)胞外基質(zhì)來參與血管的形成。陳博等［4］用HIF-α基因轉(zhuǎn)染大鼠的骨骼肌細(xì)胞后可增加具有正常功能的VEGF蛋白的分泌，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。Li等［5］研究發(fā)現(xiàn)，與VEGF表達(dá)增強(qiáng)的野生型HIF-1α組比較，不表達(dá)VEGF HIF-1α剔除組鼠胚胎成纖維細(xì)胞的遷移明顯降低。Geiger等［6］在兔橈骨缺損處植入VEGF165-活化基因基質(zhì)后用免疫組織化學(xué)染色法顯示VEGF組的血管生成量是對照組的2～3倍。EPO通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，上調(diào)VEGF、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)，增加血小板對微血管的黏附能力及其活性以促進(jìn)血管的發(fā)生。Kawachi等［7］在豬的心肌梗死試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，EPO組有大量血管形成，且HGF、FGF、IGF、VEGF 表達(dá)升高，同時(shí)誘導(dǎo)前體內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血區(qū)遷移促進(jìn)血管的發(fā)生。Kato等［8］通過建立小鼠后肢局部缺血模型發(fā)現(xiàn)，與磷酸鹽緩沖液治療相比，EPO治療組恢復(fù)了血流，黏附血小板的微血管密度和可溶性血小板上P選擇蛋白增加，中和P選擇蛋白后血流受損，黏附血小板的微血管密度降低。

3 HIF-1α對成骨細(xì)胞的調(diào)控

HIF-1α有利于恢復(fù)低氧環(huán)境中成骨細(xì)胞增殖活性，加快其增殖速率，增強(qiáng)成骨功能。第一，直接調(diào)控:HIF-1α促進(jìn)成骨細(xì)胞骨鈣素(osteocalcin，OC)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表達(dá)，OC由成骨細(xì)胞合成分泌，是評價(jià)骨形成、骨轉(zhuǎn)換和成骨細(xì)胞活性的特異性指標(biāo)，在骨礦化中起重要的作用。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志。第二，通過其他基因間接調(diào)控:①VEGF的調(diào)控直接影響前體成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增強(qiáng)再生骨的礦化。②IGF1和IGF2，目前發(fā)現(xiàn)IGF1更有潛能，它能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化并最終增加骨基質(zhì)的生成以及OC和ALP的合成，同時(shí)它對前體成骨細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞還有抗凋亡保護(hù)作用。IGF2能夠調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。③轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族包括TGF-β、骨 形 成 蛋 白 (bone morphogenetic protein，BMP)兩個(gè)亞家族，主要是由成骨細(xì)胞和血小板產(chǎn)生。TGF-β信號能促進(jìn)前體成骨細(xì)胞的增殖、早期分化和基質(zhì)的產(chǎn)生。BMP 中的 BMP-2、-4、-5、-6、-7都具有很強(qiáng)的成骨能力，BMP-2能大大增加OC的表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，是強(qiáng)有力的成骨性分化因子。BMP-7能誘導(dǎo)ALP的表達(dá)和促進(jìn)基質(zhì)礦化。④骨特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，RUNX2的兩個(gè)主要亞基是T1和T2，對成骨細(xì)胞的分化和成熟具有重要的意義。T1 RUNX2在早期的前體成骨細(xì)胞中表達(dá)，能促進(jìn)BMP2的形成，BMP2刺激T2 RUNX2的產(chǎn)生，繼之促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。RUNX2與HIF-1α共同存在前體成骨細(xì)胞的胞核內(nèi)，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上協(xié)同促進(jìn)成骨作用。第三，誘導(dǎo)血管形成間接調(diào)控:增加的血管侵入骨組織，能夠提供成骨性因子和運(yùn)送前體成骨細(xì)胞，進(jìn)而啟動成血管和成骨作用的級聯(lián)反應(yīng)。

此外，HIF-1α可刺激外周血的單核細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［9］。Shomento等［10］研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 缺失鼠的松質(zhì)骨體積明顯減少，骨形成的速度延緩，同時(shí)成骨細(xì)胞的增殖減慢。劉曉東等［11］研究證實(shí)，與21%O2相比，2%O2時(shí)成骨細(xì)胞的HIF-1α和VEGF表達(dá)增加，OC水平增高，同時(shí)成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶分泌以及鈣結(jié)節(jié)形成能力也逐漸增強(qiáng)。另外，激活成骨細(xì)胞的HIF-1α信號通路能有效地對抗雌激素降低引起的骨缺失［12］。

4 HIF-1α對破骨細(xì)胞的調(diào)控

破骨細(xì)胞是負(fù)責(zé)骨吸收的多核細(xì)胞，來源于循環(huán)系統(tǒng)中單核巨噬細(xì)胞系的造血前體干細(xì)胞，為氧感應(yīng)細(xì)胞。HIF-1α主要是通過靶基因VEGF、Bcl-2/腺病毒E1B 19×10結(jié)合蛋白3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、血管生成素4等間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性和分化，增加其骨吸收能力。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是破骨細(xì)胞分化和成熟的必要條件［13］。低氧時(shí)VEGF表達(dá)，它能替代M-CSF促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，募集單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞，并支持破骨細(xì)胞的存活和活性［14］。其機(jī)制為VEGF激活單核細(xì)胞的VEGF受體1，從而刺激單核前體破骨細(xì)胞的遷移;VEGF與激活的VEGF受體1結(jié)合使前體單核細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞核因子κB受體活化因子，并與成骨細(xì)胞上的RANKL結(jié)合來促進(jìn)單核破骨細(xì)胞分化;破骨細(xì)胞自身分泌的VEGF與VEGF受體2結(jié)合后反過來支持自身的存活和活性;HIF-1α通過下游基因BNIP3來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的自噬作用。Dandajena等［15］把外周血單核細(xì)胞和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，只有低氧時(shí)成骨細(xì)胞的HIF、VEGF和RANKL表達(dá)上調(diào)時(shí)才能觀察到破骨細(xì)胞。說明單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化與RANKL、HIF、VEGF緊密聯(lián)系。HIF-1α對破骨細(xì)胞功能的調(diào)控部分是通過血管生成素4調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性來實(shí)現(xiàn)的，后者通過激活不同的細(xì)胞內(nèi)信號通路來增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性［16］。Zhao等［17］研究發(fā)現(xiàn)，低氧通過HIF-1α/BNIP3調(diào)控前體破骨細(xì)胞的自噬作用使其胞質(zhì)內(nèi)容物降解和結(jié)構(gòu)調(diào)整以形成破骨細(xì)胞，此外HIF-1α對軟骨細(xì)胞的存活、增殖、分化和軟骨基質(zhì)的形成也有非常重要的影響［18］。HIF-1α可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨性細(xì)胞系分化，并且增加ALP的活性和Ⅰ/Ⅲ型膠原的產(chǎn)生［19］。

5 結(jié)語

HIF-1α與血管發(fā)生、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的調(diào)控緊密相關(guān)。新生血管可以向骨損傷處輸送成骨細(xì)胞和前體破骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞還能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系。此外，血管生成因子(如VEGF)通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生成骨性生長因子調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞的募集，成骨細(xì)胞的增殖、分化及破骨細(xì)胞的活性。

骨缺損修復(fù)依然是臨床上面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，不論是自體骨還是異體骨移植都有來源受限、損害供體部位和免疫排斥反應(yīng)等問題，HIF-1α在骨缺損修復(fù)中具有重要的促進(jìn)作用。然而，它受多因素調(diào)控，如何在時(shí)間、量上控制它，使其最有利于骨生成，又不會出現(xiàn)不良反應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。同時(shí)HIF-1α對一些骨系細(xì)胞功能的調(diào)控還有許多問題沒有得到證實(shí)，快速形成新的脈管網(wǎng)絡(luò)也依然是個(gè)挑戰(zhàn)。HIF-1α在血管再生方面有很突出的優(yōu)勢，但它在常氧下易分解，因此目前很多實(shí)驗(yàn)研究通過基因工程來穩(wěn)定HIF-1在常氧下表達(dá)，并與骨組織工程技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，從而為骨缺損的治療提供一個(gè)新的途徑。

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