腫瘤干細(xì)胞分離鑒定方法的研究進(jìn)展

程俊美 謝 峰 王 慧

山東菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室

早在19世紀(jì)中期就有科學(xué)家在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞十分形似。到20世紀(jì)50年代前后，Lorentz等的骨髓移植實驗成功，表明在造血細(xì)胞中存在一類原始的造血細(xì)胞即造血干細(xì)胞(HSC)，它們具有自我更新或自我復(fù)制的能力，能向骨髓中的各系細(xì)胞分化，以維持機(jī)體的正常造血功能。許多學(xué)者提出腫瘤干細(xì)胞(CSC)假說，Reya等[1]認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細(xì)胞充當(dāng)干細(xì)胞的角色，具有無限增殖的潛能，在啟動腫瘤的形成和生長中起著決定性的作用。

之后，研究者們又從人和動物的多種腫瘤及腫瘤細(xì)胞系中分離鑒定出了CSC。根據(jù)目前已有的研究，對于CSC的分離純化主要有根據(jù)細(xì)胞表型特征和生物學(xué)特性而建立的兩大類方法，即依賴于細(xì)胞表面標(biāo)志的分離方法和根據(jù)干細(xì)胞外排DNA結(jié)合熒光染料Hoechst33342而建立的SP細(xì)胞分離法。

1 依賴細(xì)胞表面標(biāo)志的分離方法

要通過表面標(biāo)志對CSC進(jìn)行分離，必須確定CSC的特異性表面標(biāo)志(或標(biāo)志物組合)。考慮到CSC既屬于腫瘤細(xì)胞也類似于正常干細(xì)胞的特性，對CSC分離標(biāo)志選擇的一般原則為：結(jié)合譜系標(biāo)志——CSC一般不表達(dá)分化的譜系標(biāo)志即Lin-(譜系標(biāo)志：CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64、CD140b)；正常干細(xì)胞特異性標(biāo)志——如分離BTSC的CD133和分離LSC的CD34[2]等；以及正常組織特異性標(biāo)志——如分離乳腺癌的上皮特異性標(biāo)志ESA等進(jìn)行綜合評價；除此之外，結(jié)合陽性標(biāo)志和陰性標(biāo)志可以更有效地分離腫瘤干細(xì)胞。目前，已經(jīng)用這種方法分離鑒定出了多種腫瘤的CSC。

1.1 造血系統(tǒng)腫瘤干細(xì)胞1997年，Bonnet等用放射線照射非糖尿病型重癥聯(lián)合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠，破壞其骨髓后導(dǎo)入人造血干細(xì)胞，觀察到有新的血細(xì)胞產(chǎn)生。他們又用同樣的方法發(fā)現(xiàn)只有很少的急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞可在小鼠體內(nèi)形成AML移植瘤，用各種細(xì)胞表面標(biāo)志對這些AML的起始細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞并不帶有成熟細(xì)胞的標(biāo)志物，而是表型為CD34+CD38-的細(xì)胞亞群。該細(xì)胞群具有明顯的增殖、分化和自我更新能力，只需要5×103就可以在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成AML。盡管這些細(xì)胞只占AML細(xì)胞的0.2%，但它們是唯一能在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成移植瘤的細(xì)胞，故CD34+CD38-表型的細(xì)胞就被認(rèn)為可能是LSC。Passegue等[3]進(jìn)一步證實了CD34+CD38-Thy-1-的細(xì)胞是LSC。正常造血干細(xì)胞的表型則為CD34+CD38-Thy-1+，兩者非常相似。所以，LSC可能來源于的Thy-1-祖細(xì)胞，或者是喪失了Thy-1+表達(dá)能力的干細(xì)胞。

1.2 實體瘤腫瘤干細(xì)胞

1.2.1 乳腺癌與腫瘤干細(xì)胞 Al-Hajj等[4]將人乳腺癌組織的細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪組織中，建立了可靠的人乳腺癌起始細(xì)胞(BrCa-IC)體內(nèi)試驗?zāi)Ｐ?，并初步用與乳腺癌細(xì)胞相關(guān)的表面分子CD44和CD22、乳腺/卵巢癌特異性標(biāo)志(B38.1)及上皮細(xì)胞特異性抗原，鑒定了BrCa-IC即乳腺癌腫瘤干細(xì)胞，提出乳腺癌組織中表面分子為ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的細(xì)胞是乳腺癌CSC 。雖然這些細(xì)胞只占所有乳腺癌腫瘤細(xì)胞的2%，但是其重建腫瘤的能力卻是其它表型腫瘤細(xì)胞的50倍。在此次實驗中，研究者切除移植瘤后分離出ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的細(xì)胞移植于下一個小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)只需要200個該表型的細(xì)胞就能成瘤，反復(fù)移植發(fā)現(xiàn)ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的腫瘤細(xì)胞均能在下一個小鼠體內(nèi)形成與原發(fā)瘤類似的腫瘤，產(chǎn)生的新腫瘤中不僅含有ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的腫瘤細(xì)胞，還有表型各異的其它腫瘤細(xì)胞。這一特征與干細(xì)胞能自我更新和產(chǎn)生表型各異的子代細(xì)胞的特征相似。

1.2.2 腦腫瘤與腫瘤干細(xì)胞 2002年，Ignatova等[5]報道了在人皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中包含神經(jīng)干細(xì)胞樣的細(xì)胞。2003年，Singh等[2]從不同類型的腦腫瘤中分離和鑒定出細(xì)胞表面標(biāo)志為CD133+表型的一類細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有這類腫瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)中形成腫瘤球，并且能不斷增殖、自我更新、分化，更重要的是形成的腫瘤球中沒有分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，而且CD133+的腦腫瘤細(xì)胞可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤；而CD133-的腫瘤細(xì)胞則貼壁并喪失增殖和分化能力，在裸鼠體內(nèi)也無致瘤能力。故他們將CD133+的腫瘤細(xì)胞命名為腦腫瘤干細(xì)胞(BTSC)。BTSC與正常神經(jīng)干細(xì)胞有相似的細(xì)胞表面標(biāo)志，占整個腫瘤細(xì)胞總數(shù)的3.5%～46.3%。Hemmati等[6]通過對小兒腦部腫瘤的研究也得到相似的結(jié)果，認(rèn)為腫瘤來源的神經(jīng)球可能就是CSC，該細(xì)胞移植到小鼠大腦后能增殖分化，并發(fā)現(xiàn)BTSC除表達(dá)CD133外，還表達(dá)Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸絲氨酸磷酸化酶等神經(jīng)干細(xì)胞和其它干細(xì)胞的基因特征。

1.2.3 結(jié)直腸癌與腫瘤干細(xì)胞 2006年，Brien[7]等利用結(jié)腸癌患者的腫瘤新鮮樣本做成腫瘤細(xì)胞懸液，用CD133抗體標(biāo)記后注入NOD/SCID小鼠體內(nèi)，結(jié)果CD133+的細(xì)胞只需要500個即可以成瘤，而CD133-的細(xì)胞幾乎不能成瘤，未做標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞懸液需要最少1×105個才能100%成瘤，將CD133+的NOD/SCID小鼠的腫瘤細(xì)胞再次移植到新的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，結(jié)果相同。而且新形成的腫瘤與原來腫瘤的表型異質(zhì)性相似。Ricci-Vitiani等[8]也完成了同樣的研究，他們認(rèn)為占結(jié)直腸癌細(xì)胞總數(shù)約2.5%的CD133+細(xì)胞是結(jié)直腸癌細(xì)胞的起始細(xì)胞。最近，Dalerba等[9]又發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞黏附分子、CD44、CD166可以作為鑒定結(jié)直腸癌干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志。

2 SP細(xì)胞分離方法

目前還有一種不需細(xì)胞表面標(biāo)志而分離CSC的方法——根據(jù)干細(xì)胞外排DNA結(jié)合染料Hoechst33342的生物學(xué)特性而應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。

Hoechst33342是一種脂溶性的藍(lán)色熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，常用于細(xì)胞凋亡的檢測，也用于普通的細(xì)胞核染色或常規(guī)DNA染色，細(xì)胞染色后用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。1996年，Goodell等首次提出在Hoechst33342染色的骨髓細(xì)胞中存在著一群染色很淺的細(xì)胞群，通過紫外激發(fā)后用雙波長分別為450nm的藍(lán)色熒光和675nm的紅色熒光分析，其中有不到0.1%的細(xì)胞發(fā)出微弱的藍(lán)光和紅光，在流式二維分析點(diǎn)陣圖上，呈彗星狀分布在造血干/祖細(xì)胞主群的一側(cè)，因此被稱為側(cè)群(SP)細(xì)胞。該群細(xì)胞體積較小，大多處于G0～G1或S～G2M期，并且能表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志(Sca-1+Lin-/low)，在移植實驗中也表現(xiàn)出造血干細(xì)胞的特點(diǎn)。隨后的研究表明該細(xì)胞群廣泛分布于人以及恒河猴、豬、小鼠、大鼠等多種動物的骨髓、胎肝、臍血、外周血等造血組織和血液中[10-12]。除了造血系統(tǒng)和血液外，SP細(xì)胞存在于人和動物的許多重要器官，如肝、肺、脾、腎、腦、神經(jīng)、骨骼肌、心肌、睪丸、皮膚、胰腺、小腸、氣管等，參與了相應(yīng)組織的更新與再生、器官系統(tǒng)的自我重建以及成體干細(xì)胞的多器官可塑性[13-15]。

與此同時，研究者還對分離出的SP細(xì)胞的細(xì)胞特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有很多類似干細(xì)胞的特性。最早在Goodell等的致死量照射鼠的造血系統(tǒng)重建實驗中，就發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)大約為1000倍，體現(xiàn)出干細(xì)胞長期增殖的特點(diǎn)。Benchaouir等[16]發(fā)現(xiàn)多數(shù)SP細(xì)胞是處于G0期的靜止細(xì)胞，用電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)大多是滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，缺少粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，這些特征多與細(xì)胞的低代謝活性有關(guān)；進(jìn)一步分析其基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄能力與NSP細(xì)胞相比大幅降低，細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周期停滯相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而與細(xì)胞周期運(yùn)行相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，符合干細(xì)胞的慢周期特征。此外，SP細(xì)胞還具有多向分化潛能，在體外誘導(dǎo)下可以分化為多種組織細(xì)胞類型。最初的研究表明，來源于骨髓的SP細(xì)胞具有很強(qiáng)的重建造血系統(tǒng)的能力。

綜上所述，目前已有越來越多的研究證明SP細(xì)胞廣泛存在于人和動物的多種成體組織、實體瘤及腫瘤細(xì)胞系中，并具有干細(xì)胞樣特征。因此對SP細(xì)胞的研究不僅有助于增加人們對干細(xì)胞各種特性的理解，而且也提供了一種從組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中分離純化和利用干細(xì)胞的策略，尤其是在干細(xì)胞表面標(biāo)志物不明的情況下更是如此。

[1] Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem cells,cancer,and cancer stem cells [J].Nature,2001,414 (6859):105-111.

[2] Sing SK,Clarke ID,Terasaki M,et al.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors [J].Cancer Res,2003,63(18):5821-5828.

[3] Passegue E,Jamieson CH,Ailles LE,et al.Normal and leukemia hematopoiesis:are leukemia a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(1):11842-11849.

[4] Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

[5] Ignatova TN,Kukekov VG,Laywell ED,et al.Human cortical glial tumors contain neural-stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro [J].Glia,2002,39(7):193-206.

[6] Hemmati HD,Nakano I,Lazareff JA,et al.Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(25):15178-15183.

[7] O`Brien CA,Pollett A,Gsllinger S,et al.A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immunodeficient mice [J].Nature,2007,445(7123):106-110.

[8] Ricci-Vitiani L,Lombardi DG,Pibzzi E,et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells [J].Nature,2007,445(7123):111-115.

[9] Dalerba P,Dylla SJ,Park IK,et al.Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells[J].Proc Natl Acad Sci,2007,104(24):10158-10163.

[10] Guo Y,Follo M,Geiger K,et al.Side-population cells from different precursor compartments[J].J Hematother Stem Cell Res,2003,12(1):71-82.

[11] Uchida N,Fujisaki T,Eaves AC,et al.Transplantable hematopoietic stem cells in human fetal liver have a CD34+side population (SP)phenotype[J].J Clin Invest,2001,108(7):1071-1077.

[12] Preffer FI,Dombkowski D,Sykes M,et al.Lineage-negative sidepopulation (SP) cells with restricted hematopoietic capacity circulate in normal human adult blood:immunophenotypic and functional characterization[J].Stem cells,2002,20(5):417-427.

[13] Asakura A,Rudnicki MA.Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation[J].Exp Hematol,2002,30(7):339-345.

[14] Kim M,Morshead CM.Distinct populations of forebrain neural stem and progenitor cells can be isolated using side-population analysis[J].J Neurosci,2003,23 (33):10703-10709.

[15] Murayama A,Matsuzaki Y,Kawaguchi A,et al.Flow cytometric analysis of neural stem cells in the developing and adult mouse brain[J].J Neurosci Res,2002,69 (6):837-847.

[16] Benchaouir R,Rameau P,Decraene C,et al.Evidence for a resident subset of cells with SP phenotype in the C2C12 myogenic line:a tool to explore muscle stem cell biolgy[J].Exp Cell Res,2004,294(1):254-268.