VEGF、COX－2在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床意義

張 帥 沈 梁 谷維立 梁柳森

甲狀腺癌是常見(jiàn)的頭頸部?jī)?nèi)分泌腫瘤，也是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤［1，2］。由于全球范圍的飲食中所含碘量的差異，不同類(lèi)型的甲狀腺癌也呈多樣化地域分布［3］。甲狀腺癌的不同組織病理分型其惡性程度有所區(qū)別，但是都具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性［4，5］。近年來(lái)甲狀腺癌發(fā)病率有明顯上升，研究甲狀腺癌轉(zhuǎn)移對(duì)甲狀腺癌的治療和預(yù)后都具有重要的指導(dǎo)意義。國(guó)外的研究報(bào)道指出，在大多數(shù)惡性腫瘤中 VEGF(vascular epithelial growthfactor)、COX －2(cyclooxygenase)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等都密切相關(guān)［6～8］。本實(shí)驗(yàn)將甲狀腺腫瘤患者手術(shù)切除的組織進(jìn)行分析比較，采用免疫組化等方法挖掘他們之間的聯(lián)系以及其與甲狀腺癌發(fā)生規(guī)律和轉(zhuǎn)移機(jī)制。

材料與方法

1．標(biāo)本來(lái)源:收集2005年3月～2010年2月筆者醫(yī)院病理科保存的甲狀腺手術(shù)切除組織的石蠟標(biāo)本并且有病人完整資料的樣本71例，其中甲狀腺癌71例，男性27例，女性44例，年齡27～69歲，平均年齡47．3±7．3歲，乳頭狀癌30例，濾泡癌16例，髓樣癌14例，未分化癌11例。甲狀腺良性腫瘤53例，男性17例，女性36例，年齡24～73歲，平均年齡45．6±6．8歲。另外取正常甲狀腺組織9例作為對(duì)照組。所有病例均有完整的臨床資料。

2．免疫組化染色:實(shí)驗(yàn)所用兔抗人VEGF、COX－2單克隆抗體，SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司。將所有石蠟組織進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5μm，每例切取4張。根據(jù)兩種抗體的要求進(jìn)行微波加熱抗原修復(fù)，每張切片上滴加1滴3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次3min。除去 PBS，每張切片上加50μl一抗，將玻片放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。轉(zhuǎn)天用PBS洗去一抗，3×3min，滴加1滴HRP標(biāo)記的兩步法抗兔的檢測(cè)試劑，再用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察控制染色時(shí)間。最后蘇木素進(jìn)行染核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹(shù)脂封片。每組取1張切片用兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

3．染色結(jié)果判定:VEGF定位于細(xì)胞質(zhì)，有棕黃色染色顆粒認(rèn)為陽(yáng)性細(xì)胞。COX－2定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核膜，陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色。陰性細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)不著色。避開(kāi)腫瘤壞死區(qū)域及邊緣區(qū)域，隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，采用半定量對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)，兩項(xiàng)乘積則用來(lái)判斷陽(yáng)性強(qiáng)度。按陽(yáng)性著色程度評(píng)分，0分為無(wú)著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。按陽(yáng)性細(xì)胞率，＜5%記0分，5% ～25%記1分，26% ～50%記2分，51% ～75%記3分，＞75%記4分。將上述兩項(xiàng)的結(jié)果相乘，0分為陰性(－)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～6分為中等陽(yáng)性(++)，＞6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 15．0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用卡方檢驗(yàn)及Fish確切概率法，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，p＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1．甲狀腺癌、甲狀腺良性腫瘤、正常甲狀腺組織中VEGF、COX－2的表達(dá)情況:VEGF在正常甲狀腺組織中幾乎不表達(dá)，9例正常組織僅有1例染色為弱陽(yáng)性，而在甲狀腺癌腫的表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)呈棕黃色染色顆粒。在甲狀腺癌和甲狀腺良性腫瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為 77．5%(55/71)，15．1%(8/71)，甲狀腺癌組織中的VEGF表達(dá)明顯高于甲狀腺良性腫瘤與正常甲狀腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。COX－2在正常甲狀腺組織中幾乎不表達(dá)，主要表達(dá)于癌組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核膜。9例正常組織中僅有1例表達(dá)陽(yáng)性。在甲狀腺癌和甲狀腺良性腫瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為64．8%(46/71)，13．2%(7/71)。甲狀腺癌組織中的COX－2表達(dá)明顯高于甲狀腺良性腫瘤與正常甲狀腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)(表1)。

表1 甲狀腺癌、甲狀腺良性腫瘤、正常甲狀腺組織中VEGF、COX－2的表達(dá)情況

2．VEGF蛋白表達(dá)與甲狀腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系:從表2可以看出，甲狀腺癌患者性別、不同年齡段之間的VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，從腫瘤分期可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腫瘤的COX－2表達(dá)陽(yáng)性率分別為 57．9%、75%、92．3%、100%，4組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0．05)。71例甲狀腺癌中有31例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其VEGF陽(yáng)性率為90．3%，顯著高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織。兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。

表2 VEGF蛋白表達(dá)與甲狀腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3．COX－2蛋白表達(dá)與甲狀腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系:從表3可以看出，甲狀腺癌患者性別、不同年齡段之間的COX－2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，從腫瘤分期可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腫瘤的COX－2表達(dá)陽(yáng)性率分別為 52．6%、71．4%、61.5%、72．7%，4 組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0．05)。71例甲狀腺癌中有31例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其COX－2陽(yáng)性率為96．9%，顯著高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織。兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。

表3 COX－2蛋白表達(dá)與甲狀腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系

4．甲狀腺癌不同病理類(lèi)型VEGF與COX－2表達(dá)比較:從表4的數(shù)據(jù)可以看出VEGF蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌組織的病理分型有關(guān)，在乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌中VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率分別為81．8%、68．8%、55．6%、92．3%。髓樣癌的陽(yáng)性率最低，4組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。COX－2蛋白的表達(dá)與甲狀腺癌組織的病理分型有關(guān)，在乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌中COX－2的表達(dá)陽(yáng)性率分別為 81．8%、88．2%、77．7%、92．3%。4組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。

表4 甲狀腺癌不同病理類(lèi)型VEGF與COX－2表達(dá)比較

5．甲狀腺癌中VEGF與COX－2表達(dá)相關(guān)性分析:應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明71例甲狀腺癌組織中VEGF和COX－2兩者表達(dá)存在正相關(guān)，r=0．589，P ＜0．05(表 5)。

表5 甲狀腺癌組織中VEGF與COX－2表達(dá)相關(guān)分析

討 論

VEGF是一類(lèi)親肝素的蛋白多肽家族，是啟動(dòng)血管形成的一個(gè)高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，不僅對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有強(qiáng)烈的促有絲分裂活性，還能給多種細(xì)胞的遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移［9］。近年來(lái)許多研究證實(shí)他是重要的血管生成刺激蛋白。VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，還能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，這可以使血管周?chē)纬衫w維凝膠，誘導(dǎo)新生血管在甲狀腺腫瘤周?chē)纬桑瑫r(shí)腫瘤細(xì)胞通過(guò)滲透性增大的內(nèi)皮細(xì)胞能夠通過(guò)血液途徑轉(zhuǎn)移到其他器官;VEGF血漿蛋白滲入血管外并沉積于血管周?chē)?，在其他促血管生成因子的共同刺激下形成新生血管?0］。VEGF的異常高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有密切關(guān)系，是決定腫瘤生物學(xué)行為的一個(gè)重要因素。許多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)VEGF在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均有高表達(dá)，表達(dá)水平的高低也與預(yù)后和轉(zhuǎn)移程度呈一定相關(guān)性。

李云龍等［11］的研究結(jié)果顯示，VEGF在甲狀腺乳頭狀癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的兩組中表達(dá)水平存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組VEGF表達(dá)水平明顯增高，這也說(shuō)明了VEGF在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Tuttle等的研究也顯示，血清VEGF水平可以作為一個(gè)分化型甲狀腺癌的標(biāo)志物，高水平的VEGF是疾病處于活躍期的標(biāo)志，提示很可能具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性。本研究結(jié)果顯示，VEGF在乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 81．8%、68．8%、55．6%、92．3%，與正常甲狀腺組織相比，癌組織的VEGF陽(yáng)性率明顯高于正常組，且未分化癌的陽(yáng)性率最高。這也說(shuō)明VEGF在不同組織類(lèi)型的甲狀腺癌中所起的作用不同。71例甲狀腺癌中有31例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其VEGF陽(yáng)性率為90．3%，顯著高于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌組織。提示VEGF可以作為一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

人類(lèi)COX－2是前列腺素合成的主要限速酶，它參與機(jī)體多個(gè)病理生理過(guò)程。脂多糖、癌基因、維甲酸、熱休克蛋白等多種因素都可以誘導(dǎo)COX－2的合成。近年來(lái)，直腸癌、胃癌、乳腺癌中均發(fā)現(xiàn)有COX－2的高表達(dá)，揭示其可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在潛在聯(lián)系。COX－2的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖并且抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤走向惡性。Kinoshita等用COX－2 cDNA轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞株，導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞顯著增殖。COX－2在多種惡性腫瘤中表達(dá)都增加，表明COX－2的高表達(dá)和惡性腫瘤的形成有關(guān)。Lim等發(fā)現(xiàn)96．0%的頭頸部腫瘤中COX－2表達(dá)呈陽(yáng)性，COX－2的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤臨床分期、組織分型和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。COX－2的作用機(jī)制包括影響細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，增加腫瘤侵襲力，免疫抑制，加強(qiáng)致癌物的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)癌基因及抑癌基因的活性改變來(lái)發(fā)揮作用［12］。

有研究顯示，COX－2的可以上調(diào)MMPs的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性，促使腫瘤的侵襲力增加。本研究結(jié)果顯示COX－2在正常甲狀腺組織中幾乎不表達(dá)，甲狀腺癌組織中的COX－2表達(dá)明顯高于甲狀腺良性腫瘤與正常甲狀腺組織。COX－2蛋白在乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌、未分化癌中表達(dá)陽(yáng)性率分別為 81．8%、88．2%、77．7%、92．3%。具有淋巴轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌的COX－2表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到多種基因，多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控［13］。本研究顯示甲狀腺癌中VEGF和COX－2 兩者表達(dá)存在正相關(guān)，r=0．589，P ＜0．05。可能由于COX－2促使VEGF的表達(dá)升高，從而促進(jìn)腫瘤新生血管的生長(zhǎng)。兩者呈正相關(guān)性也說(shuō)明這兩種蛋白在甲狀腺癌的發(fā)展中起到了正協(xié)同作用，二者可能協(xié)同參與了甲狀腺癌的發(fā)病進(jìn)程，這將有助于加深對(duì)甲狀腺癌的分子發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 Huang SM，Lee JC，Wu TJ，et al．Clinical relevance of vascular endothelial growth factor for thyroid neoplasms［J］．World JSurg，2001，25(3):302－306

2 Tuttle RM，F(xiàn)leisher M，F(xiàn)rancis GL，et al．Serum vascular endothelial growth factor levels are elevated in metastatic differentiated thyroid cancer but not increased by short－ term TSH stimulation［J］．J Clin Endocrinol Metab，2002，87(4):1737 －1742

3 Poulaki V，Mitsiades CS，McMullan C，et al．Regulation of vascular endothelial growth factor expression by insulin－like growth factor I in thyroid carcinomas［J］．JClin Endocrinol Metab，2003，88(11):5392－5398

4 Bass MB，Sherman SI，Schlumberger MJ，et al．Biomarkers as predictors of response to treatment with motesanib in patients with progressive advanced thyroid cancer［J］．JClin Endocrinol Metab，2010，95(11):5018－5027

5 Gule MK，Chen Y，Sano D，et al．Targeted therapy of VEGFR2 and EGFR significantly inhibits growth of anaplastic thyroid cancer in an orthotopic murine model［J］．Clin Cancer Res，2011，17(8):2281 －2291

6 Hsueh C，Lin JD，Wu IC，et al．Vascular endothelial growth factors and angiopoietins in presentations and prognosis of papillary thyroid carcinoma［J］．J Surg Oncol，2011，103(5):395 － 399

7 Siironen P，Ristimaki A，Narko K，et al．VEGF－Cand COX－2 expression in papillary thyroid cancer［J］．Endocr Relat Cancer，2006，13(2):465－473

8 Lee KJ，Jung YS，Kim WH，et al．Cyclooxygenase－2 expression in human thyroid disease［J］．JEndocrinol Invest，2008，31(2):111 －118

9 Yates CM，Patel A，Oakley K，et al．Erythropoietin in thyroid cancer［J］．J Endocrinol Invest，2006，29(4):320 － 329

10 Siironen P，Louhimo J，Nordling S，et al．Prognostic factors in papillary thyroid cancer:an evaluation of 601 consecutive patients［J］．Tumour Biol，2005，26(2):57 －64

11 李云龍，周文學(xué)，高峰，等．p21－ras、p53和VEGF在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義［J］．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，37(5):406－408

12 陳一峰，黃云鵬，蘇密龍．甲狀腺乳頭狀癌局部免疫狀態(tài)的分析［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38(5):52 －54

13 崔海東，賈忠，蔡陽(yáng)．甲狀腺癌146例臨床分析［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37(1):71－73