余甘子對大鼠非酒精性脂肪肝疾病中肝損傷和炎癥的抑制作用研究

朱 煒 俞宏斌 戴 闖 馮文明

非酒精性脂肪肝疾病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種有著與酒精性脂肪肝疾病類似的肝組織學病理改變，但并非由于過量攝入酒精(男性每日30g，女性每日20g)而引起的臨床病理綜合征［1］。NAFLD包含的病癥很廣，按病程進展可以劃分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎以及脂肪性肝纖維化。其中少數(shù)患者還會進一步發(fā)展成肝硬化和肝癌。在西方國家普通人群中NAFLD的發(fā)病率高達10%～24%，已成為其慢性肝病的首要病因。NAFLD的發(fā)病機制非常復雜，迄今尚未完全研究清楚。一般認為，NAFLD疾病的發(fā)生和發(fā)展可以歸納為“兩次打擊”或“多次打擊”的分子機制模型［2］。在此模型中，由于肝內(nèi)脂類代謝不平衡而引起的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)被認為是第1次打擊。胰島素抵抗發(fā)生后，胰島素受體通過自身磷酸化激活下游的MAPK通路以及相關的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(如NF－κB)，促進炎癥因子和活性氧自由基的釋放，造成細胞內(nèi)炎癥反應和氧化壓力的形成，進一步加重NAFLD。除此之外，激活的胰島素受體還會通過促纖維化因子的釋放刺激并激活肝星狀細胞(stellate cell)，促進膠原的形成，最后造成肝的纖維化。這些由胰島素抵抗而引起的肝內(nèi)病理變化統(tǒng)稱為第2次打擊或者多次打擊。在這些打擊中，炎癥反應既可以引起脂肪性肝炎的形成，又會進一步促進氧化壓力和纖維化的進程，所以在NAFLD治療中對炎癥的抑制是非常關鍵的。

余甘子是大戟科葉下珠屬植物余甘子(phyllanthus emblica L．)的果實，又名油柑子，滇橄欖等，是一種常用藏藥。中醫(yī)認為，余甘子果實味酸微澀、清熱涼血、消食健脾、生津止渴。主治血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛和口干。近年實驗研究證明余甘子具有豐富的藥理作用，包括降低脂肪、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤和抗菌抗炎等［3］。但是迄今為止并不清楚余甘子是否可以緩解NAFLD所引起的肝臟損傷。本研究旨在通過檢測在大鼠中誘導NAFLD發(fā)生的同時注射余甘子對于肝損傷和炎癥反應的抑制效果來探討余甘子對于NAFLD的治療作用。

材料與方法

1．材料:健康雌性SD大鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供;余甘子萃取的簡單流程為:取大約5g研磨自晾干的余甘子果實的粉末，在40℃條件下溶于100ml三蒸水中約1h。待溶液降到室溫后，通過Whatman濾紙過濾，收集液體萃取物放置于避光的4℃環(huán)境備用。余甘子液體萃取物中包含約干重3．4%的抗壞血酸(維生素 C)，2．2%的單寧酸和0.7%的類黃酮;谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒購于TECO Diagnostics公司;腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白介素 －1β(IL－1β)和環(huán)氧合酶 －2(COX－2)的引物設計均基于Genbank數(shù)據(jù)庫并參考Primer Bank數(shù)據(jù)庫。引物序列如表1所示。引物合成由寶生物工程有限公司完成。3種基因的抗體均購自于Santa Cruz公司;SV Total RNA試劑盒購自于Promega公司;SYBR ExScript RT－PCR購于Takara公司;總蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司。

2．方法:(1)動物模型的建立:將21只8～10周健康雌性SD大鼠置于實驗室環(huán)境中以普通飼料喂養(yǎng)適應1周后將其分為3個研究組(n=7):對照組、NAFLD組和余甘子處理NAFLD組。其中對照組大鼠自由進食普通飼料和水。對于NAFLD組的大鼠，在其普通飼料中另加10%的豬油以及2%膽固醇后，令其自由進食飼料和水。余甘子處理NAFLD組即為在NAFLD組大鼠的飼育基礎上，每日每只大鼠腹腔注射0．06ml/g余甘子萃取物。8周后所有大鼠斷頸處死，將肝臟冷凍于液氮中備用，并抽取新鮮血液于5000r/min離心10min獲得血清樣品后冷凍備用。(2)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄:大鼠肝臟組織經(jīng)液氮研磨后使用SV Total RNA試劑盒提取總RNA，隨后根據(jù)SYBR ExScript RT－PCR試劑盒的說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于－20℃下保存。(3)熒光實時定量PCR(real－time PCR):Real－time PCR按照SYBR ExScript RT－PCR建議的體系和條件于applied biosystems prism 7900 real－time PCR機器上完成，所有引物的退火溫度均優(yōu)化至60℃。人類GAPDH作為內(nèi)參照進行同步PCR擴增(表1)。Real－time PCR結果使用2－ΔΔCt法進行分析并以對照組百分數(shù)的形式于結果中表示。(4)免疫印跡分析(Western blotting):按照總蛋白試劑盒的方法提取肝臟組織總蛋白后使用BCA法(Bio－Rad)定量，每個樣品取100μg總蛋白進行免疫印跡分析。

3．統(tǒng)計學方法:實驗結果采用SPSS 11．0軟件進行統(tǒng)計分析。采用方差分析，兩兩比較時采用SNK法，p＜0．05認為具有統(tǒng)計學差異。

表1 用于實時PCR檢測的引物序列

結 果

1．實驗前后肝臟組織學變化:SD大鼠經(jīng)過8周高脂飼料的飼養(yǎng)后，與對照組相比，整個肝組織，尤其是肝小葉中央靜脈附近出現(xiàn)明顯的細胞壞死和炎癥部位。肝內(nèi)可見大量的脂肪顆粒累積。余甘子處理NAFLD組的大鼠肝臟中的細胞壞死和炎癥位點明顯減少，肝內(nèi)脂肪顆粒的累積亦有顯著改善，提示余甘子的處理可顯著改善肝內(nèi)由NAFLD所引起的細胞壞死、炎癥反應以及脂肪累積(圖1)。

圖1 肝組織切片HE染色

2．血清內(nèi)ALT及AST變化:ALT及AST的含量是血清中提示肝損傷的重要指標。與對照組相比，NAFLD大鼠血清中ALT和AST的表達量顯著上升(P ＜0．001)，提示肝損傷的發(fā)生。加入余甘子協(xié)同處理后，大鼠血清中ALT和AST的表達量顯著下降，恢復到與對照組類似的水平(表2)。

表2 余甘子對大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響(U/L)

3．肝內(nèi)炎癥因子的變化:為了研究NAFLD發(fā)生后大鼠肝臟內(nèi)炎癥反應的變化，我們選取了3種炎癥指示因子:TNF－α、IL－1β和COX－2來進行測定研究。定量PCR和免疫印記法的結果均表明，大鼠經(jīng)NAFLD誘導后，肝內(nèi)3種炎癥因子的mRNA和蛋白表達水平均顯著上升(p＜0．001)。經(jīng)過余甘子協(xié)同處理后，與NAFLD組相比，3種因子的表達量顯著下降(p＜0．01)，其中IL－1β的表達量更下降到對照水平，提示余甘子處理可以有效地從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平同時抑制肝內(nèi)的炎癥反應(圖2)。

討 論

本研究通過喂飼高脂飼料予雌性SD大鼠成功地建立了NAFLD模型，模擬了人類NAFLD疾病中肝臟的損傷以及炎癥的發(fā)生。由于雌性大鼠比雄性大鼠更容易受到NAFLD的損傷，所以我們選擇雌性大鼠作為本研究的研究對象［4］。作為一種傳統(tǒng)藏藥，萃取的余甘子溶液有效地減少了大鼠肝臟組織學上的損傷，降低了血清中ALT和AST的表達水平，亦在分子水平上抑制了肝內(nèi)炎癥因子的表達，顯示余甘子對于治療NAFLD的潛力。

圖2 各組大鼠肝內(nèi)促炎癥因子的表達變化

NAFLD的發(fā)生首先是從肝內(nèi)脂類代謝的平衡被打破開始的。肝臟內(nèi)不斷累積的脂肪顆粒會造成肝內(nèi)和循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)游離脂肪酸的增加。游離脂肪酸和其他脂類代謝中間物會損傷肝細胞細胞器的正常功能，從而引起胰島素抵抗、氧化壓力的形成、炎癥反應、肝臟纖維化以及細胞的壞死和凋亡［5］。炎癥反應是NAFLD病癥發(fā)展中的關鍵事件。由“第1次打擊”胰島素抵抗所引起的過氧化分子會引起肝臟內(nèi)庫普弗細胞的反應，釋放出一些促炎癥反應細胞因子，如TNF－α和IL－1β等，引起肝內(nèi)的炎癥反應，從而啟動下游的促凋亡反應或者抗凋亡反應以清除肝內(nèi)受到損傷的細胞。此外，肝臟炎癥中釋放的某些因子，如一氧化氮合成酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)亦能反過來通過一氧化氮通路促進更多活性氧自由基的釋放，加重已有的肝內(nèi)氧化壓力。另一方面，激活的細胞因子(如TNF－α)還可以激活促纖維化因子的表達，使得肝內(nèi)星形細胞合成膠原，造成肝內(nèi)的纖維化。所以在NAFLD的治療中，對于肝臟內(nèi)炎癥反應的抑制是非常重要的。在本研究中余甘子的協(xié)同處理有效地從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平抑制了3種炎癥因子的表達，同時從下游組織學結果來看也顯著地減少了肝組織內(nèi)的壞死細胞和血液中肝損傷指示酶的水平，說明余甘子的炎癥抑制效果是很明顯的。但是余甘子是否還可以有效降低肝內(nèi)氧化壓力和纖維化的水平尚需進一步的研究。

綜上所述，我們認為在大鼠NAFLD模型中，每日注射0．06ml/g余甘子萃取物可以顯著減少肝組織損傷，降低肝內(nèi)炎癥反應，有利于NAFLD的治療。

1 Assy N，Nasser G，Kamayse I，et al．Soft drink consumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors［J］．Can JGastroenterol，2008，22(10):811 －816

2 Polyzos SA，Kountouras J，Zavos C．Nonalcoholic fatty liver disease:the pathogenetic roles of insulin resistance and adipocytokines［J］．Curr Mol Med，2009，9(3):299－314

3 成曉梅，魏屹．余甘子的研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學．2010，38(24):13094，13099

4 Sharma MR，Polavarapu R，Roseman D，et al．Transcriptional networks in a rat model for nonalcoholic fatty liver disease:a microarray analysis［J］．Exp Mol Pathol，2006，81(3):202 －210

5 Malaguarnera M，Di Rosa M，Nicoletti F，et al．Molecular mechanisms involved in NAFLD progression［J］．J Mol Med，2009，87(7):679－695