實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)3種不同標(biāo)本中巨細(xì)胞病毒檢出率的比較

余鵑春 王 左 項(xiàng)貴明 吳佳燕

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬于皰疹病毒科β屬，是一種有包膜的雙鏈線性DNA病毒，直徑大約 200nm，基因組長約 220～245kb，是人類先天性病毒感染的主要病原，同時(shí)也是機(jī)體免疫功能低下的人群的常見并發(fā)感染的死亡原因，如器官移植以及AIDS病人［1］。CMV感染所致疾病癥狀和體征等表現(xiàn)是非特異性的，許多CMV感染的病人并不表現(xiàn)出臨床癥狀成為潛在感染狀態(tài)，必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷才能診斷［2］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種早期快速的診斷方法，目前臨床主要使用血清標(biāo)本檢測，但檢出率太低，筆者醫(yī)院2008～2009年1年間共申請(qǐng)檢查HCMV－DNA血清標(biāo)本810例，檢出14例陽性標(biāo)本，其中腎移植術(shù)后8例，血液科5例，呼吸科1例，檢出率僅為1．7%，為此筆者對(duì)膠體金標(biāo)免疫層析法檢測HCMV－IgM陽性或弱陽性的患者，分別留取血清、晨尿沉渣及外周血中單個(gè)核細(xì)胞3種臨床易獲標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)進(jìn)行檢測，以期獲得一種更適合臨床需要的檢測標(biāo)本。

對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象:筆者醫(yī)院2009年11月～2010年3月HCMV－IgM陽性或弱陽性的患者43例，分別收集這些患者的血清，晨尿和外周血中單個(gè)核細(xì)胞液標(biāo)本。同一病人具備3種標(biāo)本的21例，共有血清標(biāo)本42例，外周血單個(gè)核細(xì)胞分離標(biāo)本43例，尿沉渣標(biāo)本22例，其中腎移植術(shù)后30例，血液科7例，兒科4例，神內(nèi)皮膚科2例。女性16例，男性27例;患者年齡最小2個(gè)月，最大70歲，中位平均年齡36．7歲。

2．標(biāo)本的采集和處理:在患者知情同意下，用促凝管采集被檢者靜脈血3ml，4000r/min離心分離血清。收集被檢者中段晨尿10ml密封送檢，混勻取1ml尿液標(biāo)本于1500r/min離心10min，棄掉上清，其沉渣用于HCMV－DNA的提取。用被檢者靜脈血3ml(EDTA抗凝)，使用上海華精生物公司的Ficoll分離液，嚴(yán)格按說明書要求操作，分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。

3．HCMV－DNA測定:采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法。試劑盒由深圳匹基公司提供，批號(hào):090801。①標(biāo)本的提取:取100μl待測標(biāo)本，加入100μl DNA提取液1(PEG，NaCl)，振蕩混勻。13000r/min離心15min，吸棄上清。加入50μl DNA提取液2(Tris．base，KCl，NP40)，振 蕩 混 勻。100℃ 干 浴 10min，13000r/min離心10min，保留上清待用;②擴(kuò)增條件設(shè)置:37℃:5min;94℃:1min;95℃:5s，60℃:30s，40 個(gè)循環(huán)。試劑使用TaqMan探針，熒光信號(hào)收集選擇FAM檢測通道，熒光信號(hào)收集選擇在60℃;③結(jié)果判斷:嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。定性判斷標(biāo)準(zhǔn):CT值≤37．0的樣本為陽性;④擴(kuò)增儀器:基因公司RG3000熒光PCR檢測儀。

4．HCMV－IgM測定:膠體金標(biāo)免疫層析試驗(yàn)。使用康華生物技術(shù)有限公司TOCRCH－IgM試劑。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:3種不同標(biāo)本中檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Real－time PCR擴(kuò)增曲線見圖1、圖2;擴(kuò)增結(jié)果見表1、表2(S:血清;U:晨尿;M:外周血單個(gè)核細(xì)胞)。

Real－time PCR檢測3種不同標(biāo)本中HCMVDNA結(jié)果見表3。表3中數(shù)據(jù)顯示，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液標(biāo)本陽性檢出率20．93%，晨尿沉渣標(biāo)本HCMV－DNA陽性檢出率為18．18%，都顯著高于血清標(biāo)本陽性檢出率4．76%。

表3 實(shí)時(shí)PCR檢測不同標(biāo)本中HCMV－DNA結(jié)果比較

討 論

目前用實(shí)時(shí)PCR檢測HCMV的臨床標(biāo)本可以有以下幾種標(biāo)本:血清、尿液、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液、羊水、乳汁，支氣管肺泡灌洗液，腦脊液等［3，4］。至今以何種標(biāo)本作為臨床常規(guī)檢查標(biāo)本仍有爭議，因羊水、乳汁等臨床標(biāo)本數(shù)量較少，單從本文所選3種標(biāo)本檢出率來看，外周血中分離的單個(gè)核細(xì)胞檢出率最高、其次是尿液、目前臨床開展最廣泛的血清檢出率是最低的。

HCMV主要侵襲血液有核細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)潛伏或增殖，同時(shí)提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過了離心濃縮過程，相對(duì)提高了病毒濃度，故外周血中單個(gè)核細(xì)胞檢出率高，但由于其操作程序復(fù)雜，且受白細(xì)胞數(shù)量影響較大，對(duì)于骨髓移植術(shù)后早期白細(xì)胞缺乏或使用抗病毒藥物影響白細(xì)胞數(shù)量低時(shí)檢測將受到限制［5］。劉廣印等［6］提出用 NH4Cl裂解紅細(xì)胞代替淋巴細(xì)胞分離液，此法簡便易操作，結(jié)果可靠，特別適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，可向臨床實(shí)驗(yàn)室推薦使用。

HCMV最易侵犯管道上皮細(xì)胞，尤其是腎臟及肝膽系統(tǒng)。CMV在腎小球和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，經(jīng)尿液排出，因此可在尿液中檢測，檢出陽性率高［7］。尿液標(biāo)本中HCMV量可很好反映機(jī)體內(nèi)HCMV病毒量，且取材方便、無創(chuàng)、易為患者接受。對(duì)需長期監(jiān)測HCMV病毒載量的移植病人和小兒患者為最適用標(biāo)本，不失為理想的臨床檢測標(biāo)本。但尿液存在取材可能被污染和CMV感染治愈后仍有排毒現(xiàn)象，易造成假陽性。

HCMV感染機(jī)體，侵入細(xì)胞后開始增殖，增殖一定程度后可誘發(fā)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)釋放出宿主細(xì)胞里的病毒，血清里的病毒達(dá)到一定數(shù)量之后，我們才能檢測到血清里的巨細(xì)胞病毒，故血清檢出率較低。但血清標(biāo)本的檢出能比較好的反映感染的活動(dòng)性，且有統(tǒng)一的參考范圍，可以對(duì)疾病有良好的評(píng)價(jià)。

綜上所述，外周血中單個(gè)核細(xì)胞的HCMVDNA檢出率高，檢測結(jié)果穩(wěn)定特異，是理想的臨床檢測標(biāo)本，同時(shí)晨尿沉渣也因其陽性率較高、取材方便、無創(chuàng)、易為患者接受等，也可根據(jù)患者情況予以選擇，但二者的參考區(qū)間是否與血清一致，還有待進(jìn)一步研究。

1 Soderberg NC．HCMV microinfections in inflammatory diseases and cancer［J］．J Clin Virol，2008，41(3):218 － 223

2 張書紅．人巨細(xì)胞病毒感染檢測方法的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(22):3495－3497

3 Murata H，Nii R，Ito M，et al．Quantitative detection of HCMV － DNA in saliva from infants and breast milk on real－time polymerase chain reaction［J］．Pediatr Int，2009，51(4):530 －534

4 Xue W，Liu H，Yan H，et al．Methodology for monitoring cytomegalovirus infection after renal transplantation［J］．Clin Chem Lab Med．2009，47(2):177 －181

5 陳俊青，劉霆．巨細(xì)胞病毒感染檢測方法的現(xiàn)況和進(jìn)展［J］．中國輸血雜志，2005，18(5):428 －431

6 劉廣印，周光庭，沈佐君．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測巨細(xì)胞病毒兩種白細(xì)胞提取方法對(duì)比分析［J］．淮海醫(yī)藥，2007，5(2):95－96

7 Bergallo M，Costa C，Terlizzi ME，et al．Reverse transcriptase－ polymerase chain reaction to evaluate human cytomegalovirus lytic gene expression［J］．Mol Biotechnol，2008，40(2):144 －150