eIF4E和cyclinD1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義

朱慧能 張 谷 陳麗榮

真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E)是mRNA帽結(jié)合磷蛋白，是帽依賴(lài)性mRNA翻譯過(guò)程中的限速因子，在蛋白質(zhì)合成的起始階段起重要的調(diào)控作用，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，并具有抗凋亡活性［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E基因又是一種原癌基因，可影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，在人類(lèi)很多惡性腫瘤，例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、甲狀腺癌及膽管癌等，均發(fā)現(xiàn)腫瘤和腫瘤旁組織中eIF4E過(guò)度表達(dá)并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，抑制eIF4E的表達(dá)可以減少腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)［2～6］。結(jié)直腸癌組織中eIF4E表達(dá)水平、生物學(xué)意義及其與細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的關(guān)系，目前尚不十分明確，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究也較少見(jiàn)。本研究旨在探討eIF4E和cyclinD1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用和防治策略上的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

1．臨床資料:收集浙江省腫瘤醫(yī)院2001年1月～2003年12月收治的80例原發(fā)性結(jié)直腸腺癌(colorectal cancer，CRC)手術(shù)標(biāo)本，其中男性50例，女性30例，男女性別比例1．67∶1?；疾∧挲g31～82歲，平均年齡60．01歲，中位年齡60歲，每例均有詳細(xì)的臨床病理資料、手術(shù)記錄及5年以上的隨訪(fǎng)結(jié)果，術(shù)前均未接受化療和放療。另外收集20例正常結(jié)直腸黏膜和30例結(jié)直腸腺瘤組織蠟塊標(biāo)本作為對(duì)照。組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照S．R．Hamilion和CA．Rubio等主編的2000年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi):高分化:腺樣結(jié)構(gòu)＞95%，中分化:腺樣結(jié)構(gòu)50% ～95%，低分化:腺樣結(jié)構(gòu)＜50%。

2．試劑與方法:全部標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定。免疫組化標(biāo)記采用EnVision二步法，步驟:切片常規(guī)脫蠟至水;3%雙氧水封閉5～10min;蒸餾水洗2min×3;切片浸入Tris－EDTA修復(fù)液中，97℃水浴20min;PBS沖洗2min×3;一抗室溫孵育1h;PBS沖洗2min×3;二抗室溫孵育30min;PBS沖洗2min×3;DAB顯色3～5min，蒸餾水終止顯色;自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。兔抗人eIF4E單克隆抗體(克隆號(hào)C46H6，稀釋度1∶200)為美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，兔抗人cyclinD1單克隆抗體(克隆號(hào)SP4，稀釋度1∶100)為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品?？贵w的稀釋均選用DAKO Antibody Diluent。陽(yáng)性對(duì)照為已知陽(yáng)性切片，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

3．結(jié)果判定:在高倍鏡下(×400)對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞中相應(yīng)部位出現(xiàn)淡黃色到棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)如下評(píng)分:①無(wú)著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3;②陽(yáng)性范圍:＜5%為0，5% ～25%為1，26% ～50%為2，51% ～75%為3，＞75%為4。兩項(xiàng)結(jié)果相加＜2為陰性(－)，2～3為弱陽(yáng)性(+)，4～5為中度陽(yáng)性(++)，6～7為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。+～+++均作為陽(yáng)性表達(dá)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS13．0軟件包，組間比較及與臨床病理指標(biāo)的相互關(guān)系用χ2檢驗(yàn)和Fisher's確切概率法，應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)eIF4E和cyclinD1在結(jié)直腸癌中的相互間關(guān)系進(jìn)行分析，生存率計(jì)算應(yīng)用Kaplan－Meier法，生存曲線(xiàn)比較采用log－rank檢驗(yàn)，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．eIF4E和cyclinD1蛋白在正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤和腺癌中的表達(dá)。eIF4E陽(yáng)性著色定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1～圖3)，cyclinD1定位于細(xì)胞核(圖4～圖6)，eIF4E和cyclinD1蛋白在腺癌組和腺瘤組陽(yáng)性率均高于黏膜組(P均＜0．01)，在腺癌組和腺瘤組，eIF4E和cyclinD1蛋白表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P分別為 0．154、0．436)(表1)。

2．eIF4E和cyclinD1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系:eIF4E蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和5年生存期有顯著相關(guān)性(p＜0．05)。cyclinD1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(p＜0．05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期(p＜0．01)有顯著相關(guān)性(表2)。

3．結(jié)直腸癌組織中eIF4E和cyclinD1蛋白表達(dá)的關(guān)系:結(jié)直腸癌組織中eIF4E與cyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(等級(jí)相關(guān)系數(shù) r=0．914，P ＜0．01)(表3)。

4．eIF4E和cyclinD1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系:本組80例CRC病例最短生存時(shí)間2個(gè)月，最長(zhǎng)96個(gè)月，平均生存期52．83個(gè)月，中位生存時(shí)間65個(gè)月。80例CRC中，eIF4E蛋白陽(yáng)性表達(dá)74例，1、3、5 年生存率分別為 89．2%、63．5%、47.3%，eIF4E陰性表達(dá)6例，1、3、5年生存率均為100%，陰性表達(dá)組預(yù)后好于陽(yáng)性表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．046)(圖7)。80例 CRC中，cyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)44 例，1、3、5 年生存率分別為 90．9%、65．9%和47．7%;cyclinD1 陰性表達(dá)36 例，1、3、5 年生存率分別為88．9%、66．7%和55．6%，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．944)(圖 8)。

表1 eIF4E和cyclinD1蛋白在正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤和腺癌中的表達(dá)

表2 eIF4E和cyclinD1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌組織中eIF4E和cyclinD1表達(dá)的相關(guān)性

討 論

圖7 eIF4E表達(dá)與生存率關(guān)系，陰性表達(dá)組預(yù)后明顯好于陽(yáng)性表達(dá)組(P=0．046)

圖8 cyclinD1表達(dá)與生存率系，陰性和陽(yáng)性表達(dá)組生存曲線(xiàn)無(wú)顯著差異(P=0．944)

eIF4E基因定位于染色體4q21～q25，其堿基序列＞50kb，包括7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子。eIF4E基因編碼分子質(zhì)量為25kDa的多肽，以游離或復(fù)合物的形式分布于所有真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核［7］。eIF4E可特異性地與真核細(xì)胞mRNA的5'末端帽結(jié)構(gòu)(m7GpppN)結(jié)合，參與mRNA的翻譯，在帽依賴(lài)的翻譯起始階段起限制調(diào)控作用，是mRNA翻譯中最有效的調(diào)控節(jié)點(diǎn)［8］。正常情況下，由于eIF4E蛋白的有限表達(dá)及其與抑制蛋白4E－BPs的結(jié)合，具有活性的eIF4E形成是有限的，這些因素造成細(xì)胞內(nèi)mRNA互相競(jìng)爭(zhēng)與eIF4E結(jié)合送至核糖體參與翻譯過(guò)程，所以eIF4E在蛋白質(zhì)合成起始階段起限定作用。此時(shí)，編碼管家蛋白的“strong mRNAs”的翻譯將很快達(dá)到最高值而被有效的翻譯，而編碼控制細(xì)胞周期、生長(zhǎng)因子自我調(diào)控、血管生長(zhǎng)、生存和侵襲等相關(guān)的蛋白質(zhì)的“weak mRNAs”不被翻譯。當(dāng)eIF4E高表達(dá)時(shí)，選擇性地加強(qiáng)“weak mRNAs”的翻譯，使“weak mRNAs”較好的表達(dá)，細(xì)胞可能經(jīng)歷畸形有絲分裂和(或)凋亡，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，并導(dǎo)致細(xì)胞癌變［9］。

我們對(duì)80例原發(fā)性結(jié)直腸腺癌以及30例結(jié)直腸腺瘤中eIF4E蛋白的檢測(cè)表明:在結(jié)直腸腺瘤和腺癌中eIF4E蛋白的表達(dá)水平均較高(陽(yáng)性率分別為83．3%和92．5%)，與正常結(jié)直腸黏膜(陽(yáng)性率為10%)相比較組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(p＜0．01)。因此，我們認(rèn)為eIF4E蛋白表達(dá)上調(diào)可發(fā)生在從腺瘤到進(jìn)展期腺癌的結(jié)直腸癌發(fā)展的全過(guò)程，提示其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中是一種早期事件。eIF4E在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系日益被國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，已有的研究顯示，eIF4E表達(dá)水平與組織類(lèi)型、腫瘤分期、浸潤(rùn)深度有關(guān)［10，11］。本組 80 例結(jié)直腸癌的研究結(jié)果顯示:eIF4E蛋白的表達(dá)在漿(外)膜外浸潤(rùn)組(陽(yáng)性率100%)高于漿(外)膜內(nèi)浸潤(rùn)組(陽(yáng)性率85．4%)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(陽(yáng)性率100%)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(陽(yáng)性率85%)，5年死亡組(陽(yáng)性率100%)高于5年生存組(陽(yáng)性率85．7%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。提示eIF4E高表達(dá)可能與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等進(jìn)展相關(guān)，可作為臨床上結(jié)直腸癌的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。鑒于本組病例數(shù)有限，有待今后更多樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。

cyclinD1編碼基因CCNDI定位于人染色體11q13，全長(zhǎng)15000bp，有5個(gè)外顯子，編碼由295個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量36kDa，即cyclinD1蛋白。在正常組織中，cyclinD1蛋白水平通常較低，在有絲分裂原或生長(zhǎng)因子存在的情況下，cyclinD1蛋白可持續(xù)表達(dá)。表達(dá)的cyclinD1蛋白與CDK4/6結(jié)合，激活CDK4/6的蛋白激酶活性，再與pRb結(jié)合，啟動(dòng)S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)DNA的合成，加快細(xì)胞由G1期進(jìn)入 S期，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控和腫瘤發(fā)生［12］。本研究結(jié)果顯示 cyclinD1蛋白在結(jié)直腸黏膜、腺瘤和結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性率分別為0%、46．7%，55%，結(jié)直腸黏膜和結(jié)直腸癌組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(p＜0．01)。cyclinD1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(p＜0．05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期(p＜0．01)有顯著相關(guān)性;而與性別、年齡、腫瘤部位、腫塊大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)瘤栓及5年生存率等均無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0．05)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。提示cyclinD1與結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。

本研究對(duì)80例結(jié)直腸癌的eIF4E與cyclinD1蛋白表達(dá)相關(guān)性分析表明:兩者在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，eIF4E高表達(dá)可能導(dǎo)致cyclinD1表達(dá)水平增高，提示兩者在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在協(xié)同關(guān)系。這不僅有助于深入認(rèn)識(shí)eIF4E致癌的分子機(jī)制;而且，可通過(guò)抑制或降低eIF4E表達(dá)水平來(lái)降低cyclinD1等癌基因表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，這將是很好的抗腫瘤策略，可能具有良好的應(yīng)用前景。

1 Joshi B，Cameron A，Jagus R．Characterization of mammalian eIF4E family members［J］．Eur J Biochem，2004，271(11):2189 －2203

2 De Benedetti A，Graff JR．EIF4E expression and its role in malignancies and metastases［J］．Oncogene，2004，23(18):3189 －3199

3 Furic L，Rong L，Larsson O，Koumakpayi IH，et al．eIF4E phosphorylation promotes tumorigenesis and is associated with prostate cancer progression［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(32):14134 －14139

4 Choi CH，Lee JS，Kim SR，et al．Direct inhibition of eIF4E reduced cell growth in endometrial adenocarcinoma［J］．JCancer Res Clin Oncol，2011，137(3):463 －469

5 Kleiner HE，Krishnan P，Tubbs J，et al．Tissue microarray analysis of eIF4E and its downstream effector proteins in human breast cancer［J］．J Exp Clin Cancer Res，2009，28(1):5

6 張波，朱成楚，陳保富，等．eIF4E基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義［J］．中國(guó)肺癌雜志，2010，13(12):1132 －1135

7 Strudwick S，Borden KL．The emerging role of translation factor eIF4E in the nucleus［J］．Differentiation，2002，70(1):10 －22

8 Culjkovic B，Topisirovic I，Skrabanek L，et al．eIF4E is a central node of an RNA regulons that governs celluar proliferation［J］．JCell Biol，2006，175(3):415 －426

9 Schmidt EV．The role of c－myc in regulation of translation initiation［J］．Oncogene，2004，23(18):3217 －3221

10 Berkel HJ，Turbat－ Herrera EA，Shi R，et al．Expression of the translation initiation factor eIF4E in thepolyp－cancer sequence in the colon［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001，10(6):663 －666

11 Yang SX，Hewitt SM，Steinberg SM，et al．Expression levels of eIF4E，VEGF，and cyclinD1，and correlation of eIF4E with VEGF and CyclinD1 in multi－ tumor tissue microarray［J］．Oncol Rep，2007，17(2):281 －287

12 Lange C，Huttner WB，Calegari F．Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1，delays neurogenesis，and promotes the generation and expansion of basal progenitors［J］．Cell Stem Cell，2009，5(3):320 －331