骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7調(diào)節(jié)腎病鼠Wnt1/β－catenin信號通路

余 健 聶國明 齊曼麗 鄒敏書 李 琳 羅莉漫 徐洪濤 丁冬勝

Wnt信號通路因其啟動蛋白Wnt而得名，其中Wnt/β－連環(huán)蛋白(catenin)信號通路為經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:Wnt蛋白與其受體復(fù)合體結(jié)合，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白β－catenin活化，并轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，從而改變目的基因的表達(dá)，此信號通路在器官的發(fā)育、心血管疾病及腫瘤等起調(diào)控作用［1，2］。近年來，Wnt/β － catenin在腎臟疾病調(diào)控作用日漸受到重視，可誘導(dǎo)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(EMT)、腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，成為抗腎纖維化治療的靶點(diǎn)之一［3］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP－7)是轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)超家族成員之一，它在胚胎腎臟的發(fā)育以及成體腎臟功能的維持上具用重要作用。與TGF－β1誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腎纖維化作用相反，BMP－7是重要的足細(xì)胞存活因子及抗纖維化因子［4、5］。足細(xì)胞位于腎小球濾過屏障的最外層，主要防止血漿蛋白的濾出，BMP－7可通過激活Smad1/5/8信號通路并抑制TGF－β/Smad2/3信號通路從而減輕足細(xì)胞損傷［6］。BMP－7對 Wnt1/β －catenin信號通路的影響尚不清楚。為此，本研究探討B(tài)MP－7對Wnt1/β－catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用。

材料與方法

1．動物模型的制備:清潔級雄性Sprague－Dawley大鼠，約2月齡，體質(zhì)量200±20g，購自武漢總醫(yī)院動物實(shí)驗中心［動物合格證號為SYXK(鄂)2008－0007］。采用1次性尾靜脈注射嘌呤霉素氨基核苷酸100mg/kg誘導(dǎo)PAN模型［7］。大鼠首次給藥后2周尿蛋白相對穩(wěn)定時確認(rèn)PAN模型制備成功。將20只PAN模型鼠隨機(jī)分為兩組:①PAN組(n=10);②BMP治療組(BMP，n=10):自造模成功之日起，每周2次腹腔注射人重組BMP－7 30微克/(千克·次)［8］。正常組(NC，n=10)及PAN組給予等量的生理鹽水注射，每周2次。各組共治療10周。12周末實(shí)驗結(jié)束時，異戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，取腎皮質(zhì)甲醛固定、脫水、石蠟包埋備用。嘌呤霉素氨基核苷酸購自美國Sigma公司，人重組BMP－7購自美國Curis公司。

2．尿液指標(biāo)測定:處死鼠前收集24h尿液標(biāo)本，在1800r/min離心5min。隨機(jī)選擇20個高倍視野(×400)進(jìn)行紅細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果用每個視野平均紅細(xì)胞數(shù)表示;24h尿蛋白用雙縮脲法測定。

3．血清指標(biāo)測定:ELISA法測定血清 Cys C、MIF濃度。Cys C試劑盒購自上海德波生物技術(shù)公司。MIF試劑盒購自Gibco BRL公司。

4．RT－PCR檢測腎小球Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá):腎皮質(zhì)剪成1mm3左右的碎片，加膠原酶A(1mg/ml)，放入水平搖床中，輕輕搖動，37℃消化30min，后轉(zhuǎn)入100μm的篩網(wǎng)中，輕輕輾磨擠壓分離腎小球，PBS洗3次，備用。依據(jù)生產(chǎn)商(美國Invitrogen公司)操作說明，應(yīng)用TRIzol RNA系統(tǒng)提取總的RNA。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒按說明合成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板在TaqDNA聚合酶作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Primers軟件設(shè)計引物，引物序列如下:①Wnt1:正義5'－GAA CCT GCT TACAGA CTCCAA GAGT －3'，反義5'－CCG GAT TTT GGCTAT CAG A －3'，產(chǎn)物長度為98bp;②β－catenin引物:正義5'－GTCAGCTCGTGT CCT GTG AA－3'，反義:5'－ AGT GGCTGA CAG CAG CTT TT －3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為150bp;③GAPDH引物為:正義5'－ATT CGG ACG CCT GGT TAC－3'，反義5'－CTG TGC CGT TGA ACT TGC －3'，擴(kuò)增片段為180bp;擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃ 3min，進(jìn)入循環(huán)，變性95℃ 15s，退火 54℃ 80s，延伸72℃ 60s，32 個循環(huán)后72℃ 8min。將PCR產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP公司，美國)行吸光度掃描，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。

5．蛋白印跡測定腎小球Wnt1、β－catenin蛋白的表達(dá):按上述方法分離腎小球，取100mg溶解于細(xì)胞裂解液中(25 mmol/L Tris － HCl，150mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，1%Triton X －100，冰浴 1h，4℃ 12000r/min離心15min，抽提細(xì)胞總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度。取細(xì)胞裂解蛋白50μg經(jīng)Tricine SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫奶粉封閉PVDF膜2h，加入羊抗Wnt1、兔抗catenin多克隆一抗。4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1∶500稀釋)，37℃孵育2h;洗膜后加ECL試劑，顯色后，用凝膠成像及分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行定量分析。Wnt1、β－catenin蛋白相對含量用GAPDH作為內(nèi)參。

6．統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS11．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)用表示，方差齊時，多組比較用One－way ANOVA LSD方差分析;方差不齊，多組比較用Kruskal－Wallis方法，兩組間比較用Mann－Whitney方法，p＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．尿液及血清指標(biāo)檢測:PAN組尿液紅細(xì)胞(UE)及24h尿蛋白(24h UP)的排泄較NC組顯著升高(p＜0．01);血清 Cys C 較 NC 組亦顯著升高(P ＜0．01)，MIC升高(p＜0．05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BMP－6組UE及24h UP的排泄較PAN組顯著降低(p＜0．01)，血清中Cys C、MIC 降低 (P ＜0．05)，見表1。

表1 3組大鼠尿液及血清指標(biāo)的比較

表1 3組大鼠尿液及血清指標(biāo)的比較

與 NC 組相比，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．05;與 PAN 組相比，★P ＜0．01，★★P ＜0．05

組別 n UE(個/HP) 24h UP(mg) Cys C(mg/L) MIC(μg/L)10 1．97 ±1．15 0．55 ±0．18 0．60 ±0．12 5．26 ±1．33 PAN 組 10 13．90 ±4．65* 7．21 ±1．07* 1．21 ±0．36* 6．87 ±1．38＊＊BMP －6 組 10 7．68 ±4．35＊★ 5．24 ±1．06＊★ 0．90 ±0．15＊★★ 5．63 ±1．26 NC組★★

2．腎小球Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá):PAN組Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá)較NC組分別增加121%、164%(P ＜0．01);而 BMP－6組較 NC 組分別增加57．9%、50．0%(P ＜0．05 或P ＜0．01)。與PAN組比較，BMP－6組 Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá)分別減少28．5%、43．2%(P ＜0．01)，見圖 1、表2。

圖1 3組大鼠腎小球Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá)

表2 3組大鼠腎小球Wnt1、β－catenin mRNA表達(dá)相對值的比較

與 NC 組相比，*P ＜0．01，＊＊P ＜0．05;與PAN 組相比，★P ＜0．01

10 0．19 ±0．06 0．14 ±0．07 PAN 組 10 0．42 ±0．09* 0．37 ±0．09*BMP －6組 10 0．30±0．06＊★ 0．21±0．06－catenin NC組組別 n Wnt1 β＊＊★

3．腎小球Wnt1、β－catenin蛋白的表達(dá):Wnt1和β－catenin蛋白表達(dá)與兩者mRNA的表達(dá)類似。NC組Wnt1、β－catenin兩者僅微量表達(dá)。PAN組Wnt1、β－catenin蛋白表達(dá)較 NC組分別增加147%、57.6%(p＜0．01);而BMP－6組較NC組分別增加73．3%(P ＜0．01)、18．2%(P ＞0．05)。與 PAN 組比較，BMP－6組Wnt1、β－catenin mRNA的表達(dá)分別減少 29．8%、25．0%(P ＜0．05 或 P ＜0．01)，見圖 2、表3。

表3 3組大鼠腎小球Wnt1、β－catenin蛋白表達(dá)相對值的比較

與 NC 組相比，*P ＜0．01;與 PAN 組相比，★P ＜0．01，★★P ＜0．05

10 0．15 ±0．05 0．33 ±0．05 PAN 組 10 0．37 ±0．09* 0．52 ±0．07*BMP －6組 10 0．26±0．08＊★★ 0．39 ±0．06－catenin NC組組別 n Wnt1 β★

討 論

Wnts是一種分泌型糖蛋白家族，包括19種Wnt蛋白，目前僅了解其中的少部分如Wnt1、Wnt4等。β－catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，與E－鈣黏蛋白(E－cadherin)、α－連環(huán)蛋白(α－catenin)等共同參與細(xì)胞連接的構(gòu)建和細(xì)胞間的黏附機(jī)制［9］。正常狀態(tài)下β－catenin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞胞膜，極少表達(dá)于胞質(zhì)。同時β－catenin也是Wnt/β－catenin途徑的核心分子，β－catenin的異位表達(dá)即在胞質(zhì)內(nèi)聚集并進(jìn)入胞核是Wnt途經(jīng)發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵步驟:Wnts與細(xì)胞膜受體Frizzled及共同受體LRP5/6結(jié)合，激活胞質(zhì)內(nèi)的蛋白，使β－catenin的降解復(fù)合物β－catenin去磷酸化而降解減少，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，促進(jìn)EMT的發(fā)生和腎間質(zhì)的纖維化［10］。嚙鼠動物模型中，BMP－7對慢性腎疾病(CKD)有保護(hù)作用，外源性給予BMP－7減輕腎纖維化和足細(xì)胞的凋亡，使用rh BMP－7有望成為治療CKD的有效藥物之一［11］。

血清Cys C較血肌酐更早、更準(zhǔn)確反映腎損傷［12］。MIF是一種炎癥細(xì)胞因子，在CKD病人血清中升高，并與氧化應(yīng)激的標(biāo)志物密切相關(guān)［13］。本研究結(jié)果表明，PAN 組 UE、24h UP、Cys C、MIC水平較正常組均顯著升高，使用BMP－6組上述指標(biāo)明顯改善?？梢夿MP－7可減輕血尿、蛋白尿，對腎損傷及炎癥反應(yīng)有保護(hù)作用。PAN大鼠模型以足細(xì)胞足突融合及大量蛋白尿為特點(diǎn)，主要病變在足細(xì)胞［14］。腎小球足細(xì)胞是BMP－7作用的主要靶點(diǎn)。我們研究顯示，BMP－7可減少PAN鼠腎小球Wnt1和βcatenin mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，為其治療足細(xì)胞疾病提供了一定的依據(jù)。

TGF－β1是足細(xì)胞損傷因子，可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT，并抑制nephrin的表達(dá);而BMP－7是足細(xì)胞保護(hù)因子，可拮抗 TGF － β1誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生［15，16］。外源性BMP－7可有效抑制糖尿病鼠引起的nephrin表達(dá)下降，維持其在足細(xì)胞上的正常分布［8］。Dai等［17］研究表明，在體內(nèi)Wnt信號通路在足細(xì)胞功能異常和白蛋白尿中起中心作用:足細(xì)胞損傷激活Wnt/βcatenin信號通路，抑制nephrin的表達(dá)，導(dǎo)致白蛋白尿;去除足細(xì)胞β－catenin大鼠可以防止足細(xì)胞功能失常和白蛋白尿?？梢?，BMP－7的腎保護(hù)作用與拮抗 TGF－β1，抑制β－catenin通路，上調(diào)nephrin的表達(dá)有關(guān)。

總之，Wnt1/β－catenin信號可能是治療以蛋白尿為主的腎疾病的新靶點(diǎn)，而BMP－7可拮抗Wnt1/β－catenin信號通路對腎損傷的保護(hù)作用。

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