Notch2、Notch4受體在哮喘小鼠肺中的表達及布地奈德、姜黃素對其影響

崇 蕾 張維溪 聶 穎 王 婷 李昌崇

Notch受體家族廣泛存在于從無脊椎動物到哺乳動物等多種生物體內(nèi)，參與多種組織細胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能活動，近來研究表明，Notch參與外周T淋巴細胞及其亞群的分化發(fā)育過程［1，2］。支氣管哮喘是一種由多種炎癥細胞和細胞成分參與的慢性氣道炎癥性疾病，Th2細胞的分化發(fā)展是其發(fā)病的始動環(huán)節(jié)［3］。布地奈德作為一種吸入性糖皮質(zhì)激素，具有減輕氣道炎癥和抗過敏的作用，但它的具體作用機制如何，目前尚未明確。Oh等［4］研究提示，姜黃素也可明顯改善過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，故本研究利用布地奈德和姜黃素干預(yù)哮喘模型，觀察其可能的作用靶點。

材料與方法

1．材料:體重18～22kg的SPF級雄性Balb/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司;卵白蛋白(OVA)和姜黃素藥液購自美國Sigma公司;布地奈德霧化液由阿斯利康公司提供;SP二步法檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Notch2單克隆抗體和Notch4多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司;Trizol抽提試劑由美國Invitrogen公司提供;RT－PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

2．方法:(1)小鼠氣道炎癥模型的建立:將64只Balb/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，隨機分為4組，即正常對照組(A組)、哮喘組(B組)、布地奈德組(C組)和姜黃素組(D組)，每組8只。參照李昌崇等［5］方法制備哮喘小鼠氣道炎癥模型:分別于第1天和第13天經(jīng)小鼠腹腔注射0．01%OVA/Al(OH)3混合液0．1ml致敏，第25～32天每天以1%OVA生理鹽水溶液進行霧化激發(fā);布地奈德組于每次OVA激發(fā)前2h霧化吸入0．5mg/ml的布地奈德霧化液，持續(xù)至最后1次激發(fā)［6］;姜黃素組小鼠于每次激發(fā)前20min胃飼姜黃素藥液200mg/kg，持續(xù)至最后1次激發(fā)［7］;正常組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)小鼠。(2)肺組織標(biāo)本的采集及處理:各組小鼠于末次激發(fā)后24h內(nèi)處死，取左肺肺門段組織固定于4%多聚甲醛，送病理科石蠟包埋切片，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色;取右肺組織迅速置于液氮冷凍后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存，用于RT－PCR檢測。(3)肺組織中Notch2、Notch4受體蛋白的測定:用SP二步法檢測試劑盒對肺組織切片進行Notch2(1∶400)、Notch4(1∶100)免疫組化染色，陽性結(jié)果為胞膜、胞質(zhì)或胞核呈棕黃色，每張切片隨機選擇4個×400倍鏡下支氣管視野，圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度(MOD)，取其平均值作為該樣本的MOD值。(4)肺組織中Notch2、Notch4受體mRNA的檢測:用 Trizol一步法抽提總RNA，然后根據(jù)RT－RCT試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。Notch2上游引物:5'－CAACTGTGAGGTGGACAAAAATG－3'，下游引物:5'－TGTTCATACACGGCTTGGAGATA －3';Notch4上游引物::5'－CACCAGGCTTGGAAGGGAG －3'，下游引物:5'－GAAACCAGGACGGCAGAGG－3';β－actin上游引物::5'－CGGGACCTGACAGACTACCTCAT－3'，下游引物:5'－CCACAGGATTCCATACCCAAGA－3'。以上引物均由上海基康生物工程有限公司合成。Notch2、Notch4、β－actin的擴增片段長度分別為398，353，272。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，用SMART凝膠圖像分析系統(tǒng)進行條帶掃描分析，以目的基因與內(nèi)參照(β－actin)的IOD比值作為mRNA表達的相對含量。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS16．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Levene'test進行方差齊性檢驗，同一指標(biāo)各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett'T3檢驗，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．各組小鼠HE染色結(jié)果:見圖1。B組小鼠肺組織氣管支氣管周圍炎細胞浸潤明顯，以中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為著，C、D組炎細胞浸潤較B組稍減弱，而A組無炎細胞浸潤。

2．各組小鼠Notch2蛋白和mRNA表達的比較:Notch2蛋白于A組主要表達在支氣管上皮細胞的胞膜和胞質(zhì)，于B組主要表達在支氣管上皮細胞和淋巴細胞的胞核(淋巴細胞胞質(zhì)少，胞核呈圓形，幾乎占滿了細胞，通過蘇木素復(fù)染，胞核染成淡藍色)，B組Notch2受體蛋白和mRNA水平明顯高于A組(P均＜0．01)，C、D組Notch2受體蛋白和mRNA均低于B組(P ＜0．01)，但仍高于 A 組(P ＜0．01)(圖1、圖2、表1)。

圖1 布地奈德、姜黃素對Notch2受體蛋白表達的影響(×400)

3．各組小鼠Notch4蛋白和mRNA表達的比較:Notch4蛋白主要表達于支氣管上皮細胞和血管平滑肌細胞胞膜和胞質(zhì)，4組Notch4受體蛋白和mRNA差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0．05(圖3、表2)。

討 論

圖2 布地奈德、姜黃素對Notch2受體mRNA表達的影響

表1 各組小鼠肺組織中Notch2蛋白及mRNA表達的比較(n=8

表1 各組小鼠肺組織中Notch2蛋白及mRNA表達的比較(n=8

A～D分別為正常對照、哮喘、布地奈德、姜黃素組;與 A組比較，a p＜0．01，與B 組比較，b P ＜0．01

組別 蛋白mRNA A 0．049 ±0．004 0．041 ±0．007 B 0．104 ±0．005a 0．275 ±0．015a 0．075 ±0．002ab 0．088 ±0．012ab D 0．073 ±0．002ab 0．085 ±0．008 C ab

圖3 布地奈德、姜黃素對Notch4受體mRNA表達的影響

表2 各組小鼠肺組織中Notch4蛋白及mRNA表達的比較(n=

表2 各組小鼠肺組織中Notch4蛋白及mRNA表達的比較(n=

A～D分別為正常對照、哮喘、布地奈德、姜黃素組;4組Notch4受體蛋白和mRNA差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0．05

組別 蛋白mRNA A 0．121 ±0．004 0．595 ±0．019 B 0．118 ±0．003 0．601 ±0．125 C 0．117 ±0．004 0．606 ±0．145 0．117 ±0．005 0．604 ±0．019 D

Notch家族是目前備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的一類跨膜受體家族，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有4種Notch受體和5種Notch配體。Notch廣泛存在于多種生物體內(nèi)，參與多種組織細胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等功能活動，在多種細胞命運的決定中均發(fā)揮著重要作用［1］。越來越多的研究表明，Notch信號通路在調(diào)節(jié)外周T淋巴細胞分化過程中起了決定性作用，且不同的Notch受體和配體結(jié)合產(chǎn)生的效應(yīng)可完全不同，這就使得Notch家族愈發(fā)神秘難解［2，8］。但大多數(shù)研究證實，在細菌、病毒、TLR配體等Th1誘導(dǎo)因素作用下，抗原呈遞細胞(APC)表面DLL1或DLL4產(chǎn)生增多，與Notch3受體結(jié)合后可抑制Th2細胞分化，從而促進Th1細胞分化，而在蠕蟲、過敏原、毒素或前列腺素E2等Th2誘導(dǎo)環(huán)境下，APC表面Jagged1/2配體增多，與 Notch1受體結(jié)合后誘導(dǎo) Th2細胞分化［8］。而Notch2、Notch4對外周T淋巴細胞分化的作用不甚明確，且Kopan等［9］還發(fā)現(xiàn)Notch信號激活方式較一般的信號通路不同，激活后通過3次酶切作用，產(chǎn)生縮短的胞內(nèi)段，及NICD，NICD隨即進入細胞核，與靶基因結(jié)合產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。故本研究通過免疫組化染色和RT－PCR觀察Notch2和Notch4受體在Th2型免疫反應(yīng)——哮喘中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch2受體蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺組織中明顯增高，且Notch2蛋白在哮喘組中主要表達于支氣管上皮細胞和淋巴細胞的胞核，而Notch4受體蛋白和mRNA在哮喘小鼠肺組織中的表達與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明Notch2受體在哮喘小鼠氣道炎癥中發(fā)揮了一定作用，且激活后大部分轉(zhuǎn)移到了核內(nèi)，Notch4則對哮喘小鼠氣道炎癥無明顯影響。

布地奈德是一種吸入性糖皮質(zhì)激素，較之全身性皮質(zhì)激素，它局部濃度高，不良反應(yīng)少，是目前控制和緩解哮喘發(fā)作的關(guān)鍵藥物，但它的抗炎機制目前仍不十分明確，前期研究提示布地奈德可能部分通過Notch1受體發(fā)揮一定的抗炎作用，但它是否對Notch2受體也有類似的作用呢?姜黃素是從姜黃中提取出來的一種中成藥，眾多研究已證實，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用，近期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制NF－κB轉(zhuǎn)錄激活改善過敏性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，那么它也可能通過Notch2受體對哮喘氣道炎癥有一定的作用［4］。

本實驗利用布地奈德和姜黃素干預(yù)哮喘模型，發(fā)現(xiàn)布地奈德組和姜黃素組小鼠肺組織中Notch2受體蛋白和mRNA均比哮喘組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而兩組小鼠肺組織中Notch4蛋白和mRNA表達與哮喘組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示布地奈德和姜黃素均可部分通過抑制Notch2信號改善哮喘氣道炎癥［10］。

綜上所述，Notch2信號在哮喘氣道炎癥過程中也發(fā)揮了一定作用，布地奈德和姜黃素可能部分通過抑制Notch2信號改善哮喘氣道炎癥，而Notch4對哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展影響不大。近年來，哮喘的定義在不斷的改進改善，哮喘的治療方案也在不斷的演變完善，尋求更有效、不良反應(yīng)更少的治療方案是當(dāng)前醫(yī)務(wù)工作者的首要任務(wù)，深入研究藥物的作用靶點可為以后的聯(lián)合用藥提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)，為進一步完善哮喘的治療方案打下基礎(chǔ)。

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