內(nèi)皮抑素對(duì)卵黃囊瘤裸鼠模型血管生長(zhǎng)的影響

陳聰?shù)?吳碎春 王 浩 陳肖鳴 張 華

自20世紀(jì)70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來(lái)，目前已發(fā)現(xiàn)了多種血管生長(zhǎng)抑制因子，特別是近幾年抗血管生成治療發(fā)展迅速。血管內(nèi)皮抑制素(endostatin，ES)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的強(qiáng)效血管生成抑制因子，由于ES特異性地靶向作用于增生的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用。但目前國(guó)內(nèi)針對(duì)兒童生殖細(xì)胞腫瘤的抗血管治療研究甚少，幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)內(nèi)首次建立的卵黃囊瘤移植瘤模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)內(nèi)皮抑素的抗腫瘤作用進(jìn)行深入研究［1］。

材料與方法

1．材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本:裸鼠BALB/C(nu/nu)小鼠40只，雌雄各半，3～4周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。腫瘤標(biāo)本來(lái)源于小兒卵黃囊瘤荷瘤鼠第17代模型。已對(duì)荷瘤鼠腫瘤鑒定，證實(shí)保留原腫瘤生物學(xué)特性［1，2］。(2)主要試劑:重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液15毫克/(3毫升·支)，避光保存于4℃冰箱，移液器量取，加入醫(yī)用生理鹽水，配制成溶液，濃度為 0．06mg/ml及 0．03mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2．方法:(1)動(dòng)物模型建立:對(duì)荷瘤鼠第17代腫瘤生物學(xué)性質(zhì)再次鑒定，證實(shí)具有良好的原腫瘤生物學(xué)特性。按照陳聰?shù)碌龋?，2］人移植瘤模型建立的方法，把第17代腫瘤移植在40只雄性裸鼠單側(cè)腹股溝皮下區(qū)。(2)成瘤模型分組:裸鼠按照高劑量組 1．5mg/(kg·d)、低劑量組 0．75mg/(kg·d)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、空白對(duì)照組分組后開(kāi)始重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液藥物干預(yù)，每日測(cè)量裸鼠重量并記錄，依照測(cè)得體重?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算用藥量。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注射醫(yī)用生理鹽水25ml/(kg·d)，空白對(duì)照組不予干預(yù)。于實(shí)驗(yàn)第7天開(kāi)始干預(yù)，注射部位為腫瘤皮下及瘤內(nèi)。每日定時(shí)注射藥物，連續(xù)給藥14天。(3)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)量:定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤生長(zhǎng)的潛伏期和腫瘤生長(zhǎng)速度，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)3mm時(shí)，定人每隔5天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑a及橫徑b，按公式V=π/6 ×a×b2計(jì)算腫瘤體積。取第 1、3、6、9、12、15 天腫瘤體積進(jìn)行各組間點(diǎn)差異的比較。(4)免疫組化標(biāo)記:雌性裸鼠各組5只，頸椎脫臼法處死，迅速剝離腫瘤，4℃生理鹽水沖洗，觀察腫瘤標(biāo)本大體形態(tài)(表面及切面顏色、有無(wú)壞死灶)，4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫細(xì)胞化學(xué)步驟參照SP試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，AFP、CD34、VEGF的一抗?jié)舛染鶠?∶100。用Image－pro plus軟件進(jìn)行圖像分析。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的光密度。將兩項(xiàng)數(shù)據(jù)相乘即為所測(cè)樣本的免疫組化染色的相對(duì)定量結(jié)果(expression value，OD)。用CD34來(lái)計(jì)算血管密度(microvessel density，MVD)，對(duì)腫瘤的新生血管形成進(jìn)行量化。(5)腫瘤血管造影:1)藥物干預(yù)完成后，每組取雄性裸鼠各5只，4%水合氯醛溶液12ml/kg腹腔注射麻醉，沿胸骨左緣打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包膜，暴露心尖部，心尖部穿刺，明膠－氧化鉛懸濁液75ml/kg灌注，至裸鼠鼻尖、趾緣、尾尖、虹膜及腫瘤表層血管變色產(chǎn)生橘紅色斑片狀，清潔裸鼠體表，4℃冷藏過(guò)夜以便明膠凝集。2)球管至臺(tái)面的高度為102cm，曝光時(shí)間為0．25s，電流為100mA，電壓為45V，X線拍片。3)拍片后以Image－Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算腫瘤血管網(wǎng)平面面積，計(jì)算面積比率，面積比率=腫瘤血管網(wǎng)平面面積/腫瘤平面面積，對(duì)面積比率進(jìn)行各組間比較。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間比較用單因素多重方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett'T3檢驗(yàn)，取α=0．05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以p＜0．05為差異具有顯著性，p＜0．01為差異具有高度顯著性。

結(jié) 果

1．各組腫瘤生長(zhǎng)狀況:裸鼠移植腫瘤組織后1周，全部接種成功，瘤體開(kāi)始生長(zhǎng)(圖1)。給藥第1天(即分組后)及第3天測(cè)量各組間腫瘤體積均無(wú)明顯差異(F=0．567，P ＞0．05)，自第 6 天測(cè)量?jī)?nèi)皮抑素治療組，腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組(F=14．254，P ＜0．01);第12天測(cè)量結(jié)果提示高劑量組與低劑量組腫瘤體積出現(xiàn)顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積測(cè)量結(jié)果均無(wú)差異。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，內(nèi)皮抑素高劑量治療組，平均腫瘤抑制率隨治療時(shí)間的推移持續(xù)增長(zhǎng)，最高抑瘤率為第15天測(cè)得49%，明顯高于低劑量治療組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組;低劑量治療組腫瘤抑制率曲線稍有波動(dòng)，最高抑瘤率為第15天測(cè)得31%;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組腫瘤抑制率低，且呈下降趨勢(shì)，與高劑量組及低劑量組差異明顯(F=15．147，p＜0．01)，不同劑量間腫瘤抑制率存在差異(F=9.628，P ＜0．05)(表1)。

圖1 第18代卵黃囊瘤移植瘤模型

表1 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積測(cè)量結(jié)果(mm3)

2．免疫組化結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組腫瘤切片中均可見(jiàn)不同程度的AFP表達(dá)(圖2)，AFP定位于胞質(zhì)，染色陽(yáng)性者呈黃棕色，細(xì)胞核及周圍細(xì)胞間質(zhì)無(wú)AFP表達(dá)處，蘇木素染色呈藍(lán)色。CD34表達(dá)，從高劑量、低劑量、實(shí)驗(yàn)對(duì)照、空白對(duì)照的 OD 值為 7．24±4．01、12.28 ±5．59、22．32 ±3．75、22．52 ± 3．06，高劑量組MVD值明顯低于低劑量組(F=18．852，P ＜0．01)及兩對(duì)照組(F=20．198，P ＜0．01)，低劑量組 MVD 值低于兩對(duì)照組(F=11．323，P ＜0．01)，兩對(duì)照組之間無(wú)明顯差別(F=1．658，P ＞0．05)(圖 3)。各實(shí)驗(yàn)組從高劑量、低劑量、實(shí)驗(yàn)對(duì)照、空白對(duì)照的VEGF的OD 值為 12．40 ± 3．25、9．50 ± 3．12、7．08 ± 2．93、7.48±2．39，表達(dá)強(qiáng)度上，兩對(duì)照組均較強(qiáng)且之間無(wú)明顯差別(F=1．459，P ＞0．05)，低劑量組弱于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(F=11．225，P ＜0．05)，強(qiáng)于高劑量組(F=15．978，P ＜0．01)(圖4)。

圖2 移植瘤組織AFP表達(dá)(×400)

3．腫瘤血管明膠－氧化鉛造影:荷瘤裸鼠血管灌注并拍片后，由X線片可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物干預(yù)的組別，腫瘤內(nèi)部未見(jiàn)明顯的壞死空腔，兩個(gè)對(duì)照組個(gè)別腫瘤內(nèi)部可以見(jiàn)到偏心性壞死空腔。腫瘤周邊部位正常血管。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤血管面積比率:高劑量組0．36±0．12、低劑量組 0．49 ±0．04、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 0．69 ±0.07、空白對(duì)照組0．65±0．12。治療組與對(duì)照組之間存在顯著差異(F=12．989，P ＜0．01)，兩治療組之間存在差異(F=1．275，P ＜0．05)。

討 論

睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生率在過(guò)去的40年里增加了2倍，達(dá)7．5/10萬(wàn)人［1］。而兒童生殖細(xì)胞腫瘤占小兒睪丸腫瘤的60% ～75%，其中以卵黃囊瘤最多。我們首次在國(guó)內(nèi)建立了卵黃囊瘤裸小鼠移植瘤模型，并通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性的鑒定，已經(jīng)成功應(yīng)用于對(duì)卵黃囊瘤的抗腫瘤研究［2］。本次研究選取卵黃囊瘤模型，為血管密度高、血運(yùn)豐富的惡性實(shí)體瘤，而且血道轉(zhuǎn)移較多，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)該瘤血管治療的相關(guān)報(bào)道。

自20世紀(jì)70年代Folkman提出血管生成抑制療法以來(lái)，發(fā)現(xiàn)了很多具有血管抑制活性的藥物，由其是近幾年抗血管生成治療發(fā)展迅速［3～5］。針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成療法具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞的化療所不可比擬的優(yōu)越性，腫瘤細(xì)胞具有基因突變性，因而化療容易產(chǎn)生耐藥性且不良反應(yīng)大，而腫瘤內(nèi)的血管具有基因的相對(duì)穩(wěn)定性，因而不易耐藥，重復(fù)給藥有效。而血管內(nèi)皮抑制素(endostatin，ES)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的強(qiáng)效血管生成抑制因子，可通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移、拮抗腫瘤新生血管生成，阻斷腫瘤血液供應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)而使其進(jìn)入“休眠狀態(tài)”并導(dǎo)致凋亡［6，7］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，ES顯示出強(qiáng)大的特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，由于ES特異性地靶向作用于增生的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤和原發(fā)性腫瘤的種植瘤均有顯著的抑制作用，一般不會(huì)誘發(fā)骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)等化療藥物常表現(xiàn)出的不良反應(yīng)［8～11］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腫瘤組織中VEGF含量，高劑量組＜低劑量組＜實(shí)驗(yàn)對(duì)照組≈空白對(duì)照組。關(guān)于ES對(duì)VEGF的影響機(jī)制仍不十分清楚，Hohenester等［12］的研究認(rèn)為內(nèi)皮抑素可能是與bFGF和VEGF競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面的硫酸肝素黏蛋白類，阻擋有絲分裂生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并阻止內(nèi)皮細(xì)胞移向bFGF，從而抑制血管生成。目前較肯定的信號(hào)傳導(dǎo)通路有:通過(guò)抑制EGFR、Raf－Ras－MEK－MAPK、STAT3和PI3K－AKT等信號(hào)傳導(dǎo)途徑下調(diào)VEGF［13］;通過(guò)Thrombin受體啟動(dòng)PAR －1和PAR －2通路，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而減少其產(chǎn)生;影響內(nèi)皮細(xì)胞上一氧化氮合成酶的活性，減少VEGF誘導(dǎo)的一氧化氮的生成，從而抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管的形成。ES可能通過(guò)上述或者尚未知的途徑對(duì)腫瘤組織內(nèi)的VEGF起作用，從而減少其在腫瘤組織中的含量，進(jìn)而抑制新生卵黃囊瘤血管發(fā)生及進(jìn)展，但具體機(jī)制仍需后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)首次選擇明膠－氧化鉛懸濁液作為造影劑應(yīng)用于卵黃囊瘤裸鼠移植瘤模型。氧化鉛是解剖標(biāo)本血管灌注造影最常用的造影劑之一，管徑0.1mm的動(dòng)脈也可以清晰顯影，造影效果保留相對(duì)之間較長(zhǎng)可以反復(fù)拍片觀察，并且操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，適用腫瘤血管的觀察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常直觀地顯示，經(jīng)內(nèi)皮抑素干預(yù)后，腫瘤體積明顯小于未經(jīng)干預(yù)者，腫瘤內(nèi)血管管徑較小，血管分布范圍及密度低，面積比率高劑量組＜低劑量組＜實(shí)驗(yàn)對(duì)照組≈空白對(duì)照組。也驗(yàn)證了內(nèi)皮抑素抗血管生成治療的靶點(diǎn)是新生的卵黃囊瘤血管的觀點(diǎn)。

通過(guò)研究筆者發(fā)現(xiàn)，ES抑制卵黃囊瘤VEGF的生成，減少其對(duì)血管內(nèi)皮的作用，從而減少血管生成，從而抑制卵黃囊瘤裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。為卵黃囊瘤的臨床抗血管生成治療提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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