卵黃囊瘤中肝細(xì)胞核因子1β的表達(dá)及診斷價(jià)值

王月娥，李 恒，王 偉，吳海波

卵黃囊瘤(又稱內(nèi)胚竇瘤)是一種少見的高度惡性原始生殖細(xì)胞腫瘤，主要發(fā)生于卵巢及睪丸等性腺器官，性腺外器官較罕見發(fā)生[1-2]。發(fā)生于嬰幼兒的卵黃囊瘤多為單純型，成人卵黃囊瘤多為混合型[3-4]。卵黃囊瘤組織學(xué)與原始卵黃囊間質(zhì)形態(tài)相似，包括微囊/網(wǎng)狀、乳頭狀、實(shí)性、黏液瘤樣等。通常在同一腫瘤內(nèi)可見多種形態(tài)[5]。因卵黃囊瘤形態(tài)多樣，導(dǎo)致其作為混合型生殖細(xì)胞腫瘤的次要成分出現(xiàn)時(shí)，易誤診或漏診。卵黃囊瘤高度惡性，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，易侵犯周圍組織，因此正確識(shí)別卵黃囊瘤成分至關(guān)重要[6]。免疫組化染色有利于識(shí)別卵黃囊瘤的成分，但目前仍缺乏卵黃囊瘤的敏感性及特異性標(biāo)志物。

肝細(xì)胞核因子1β(HNF1β)是卵巢透明細(xì)胞癌的常用標(biāo)志物，亦可表達(dá)于子宮內(nèi)膜異位癥[7]，但其在卵黃囊瘤中的敏感性及特異性尚不清楚，目前僅有個(gè)別文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。為明確HNF1β在卵黃囊瘤中的表達(dá)及意義，本文現(xiàn)對(duì)34例卵黃囊瘤及50例非卵黃囊瘤的生殖細(xì)胞腫瘤進(jìn)行免疫組化分析，以明確HNF1β在卵黃囊瘤組織中的表達(dá)及其在鑒別診斷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011年1月～2020年11月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)診治的39例卵黃囊瘤患者，其中5例因卵黃囊瘤成分較少而被舍棄，最終選用卵黃囊瘤組織充分的34例(包括2例穿刺標(biāo)本及32例手術(shù)切除標(biāo)本)進(jìn)行分析。所有切片均經(jīng)兩位病理專家復(fù)核。同時(shí)隨機(jī)選取50例非卵黃囊瘤的生殖細(xì)胞腫瘤進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，行HE及免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用抗體包括HNF1β(兔多抗，ZA-0129)、AFP(兔單抗，EP209)、GPC-3(鼠單抗，1G12)，均購自北京中杉金橋生物公司，且設(shè)有陽性、陰性對(duì)照。既往所有病例均已行相應(yīng)標(biāo)志物的免疫組化染色，如CD117(兔單抗，EP10)、CD30(兔單抗，EP154)等。

1.3 結(jié)果判讀HNF1β表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色至棕褐色，顆粒狀；AFP及GPC-3表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10]，染色評(píng)分由染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比共同決定。(1)按染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞百分比<1%為1分，1%～10%為2分，11%～50%為3分，>50%為4分。最后將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為中等陽性，8～12分為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。敏感性及特異性的差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征34例卵黃囊瘤中單純型卵黃囊瘤20例，混合型卵黃囊瘤14例。發(fā)病部位包括卵巢、睪丸等性腺器官及縱隔、松果體等性腺外器官。

20例單純型卵黃囊瘤中，男性3例，女性17例，年齡范圍1～68歲，平均年齡21.3歲，中位年齡20.5歲。不同發(fā)病部位的腫瘤組織形態(tài)學(xué)相似：包括明顯的內(nèi)胚竇樣結(jié)構(gòu)(Schiller-Duval小體)、微囊/網(wǎng)狀、乳頭狀、實(shí)性、黏液瘤樣結(jié)構(gòu)等，間質(zhì)常伴有大量出血、壞死。其中2例患者術(shù)前進(jìn)行了化療，包括1例發(fā)生于縱隔及1例復(fù)發(fā)的卵黃囊瘤患者?；熀蠼M織學(xué)形態(tài)與原發(fā)灶相似。

14例混合型卵黃囊瘤中，男性9例，女性5例，年齡范圍5～45歲，平均年齡27.4歲，中位年齡31.5歲。混合型卵黃囊瘤中混合成分包括精原細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、未成熟畸胎瘤等。其中1例發(fā)生于陰道殘端為復(fù)發(fā)性病例，原發(fā)腫瘤為卵黃囊瘤混合無性細(xì)胞瘤。

其他生殖細(xì)胞腫瘤：本實(shí)驗(yàn)含隨機(jī)選取的50例無卵黃囊瘤成分的生殖細(xì)胞腫瘤，包括15例成熟性畸胎瘤、11例未成熟畸胎瘤、10例精原細(xì)胞瘤、6例絨毛膜癌、5例無性細(xì)胞瘤、3例胚胎性癌。

2.2 免疫表型無論患者術(shù)前是否化療，所有卵黃囊瘤中HNF1β均呈彌漫核陽性(2例弱陽性，8例中等陽性，24例強(qiáng)陽性)。在血管周樣結(jié)構(gòu)、乳頭狀、實(shí)性結(jié)構(gòu)中陽性率較高，在黏液瘤樣結(jié)構(gòu)中陽性率稍低(圖1～3)。化療后其表達(dá)未見明顯減弱(圖4)。在混合型卵黃囊瘤中，卵黃囊瘤成分HNF1β陽性(圖5、6)，其他成分均陰性。在成熟性畸胎瘤中伴有胃腸道黏膜及胰腺腺泡分化成分可見HNF1β胞核陽性，這些良性形態(tài)HE染色便可識(shí)別，一般不會(huì)誤診。部分絨毛膜癌細(xì)胞呈HNF1β胞質(zhì)著色，因其非胞核著色，故判讀為陰性。

圖1 卵黃囊瘤中血管周結(jié)構(gòu)HNF1β呈陽性，EnVision法 圖2 卵黃囊瘤中實(shí)性結(jié)構(gòu)HNF1β呈陽性，EnVision法 圖3 卵黃囊瘤中黏液瘤樣結(jié)構(gòu)HNF1β呈陽性，EnVision法 圖4 單純型卵黃囊瘤，患者化療3個(gè)療程，HNF1β染色顯示卵黃囊瘤成分陽性，EnVision法 圖5 睪丸混合型生殖細(xì)胞腫瘤(精原細(xì)胞瘤+胚胎性癌+卵黃囊瘤):精原細(xì)胞瘤見大小相對(duì)一致的腫瘤細(xì)胞彌漫分布，混雜少量淋巴細(xì)胞；胚胎性癌由異型性較大的不規(guī)則腺腔構(gòu)成；混雜少許不易觀察到的卵黃囊瘤成分 圖6 睪丸混合型生殖細(xì)胞腫瘤(精原細(xì)胞瘤+胚胎性癌+卵黃囊瘤)，HNF1β染色顯示卵黃囊瘤成分為陽性，EnVision法

34例卵黃囊瘤中AFP陰性3例，弱陽性5例，中等陽性14例，強(qiáng)陽性12例。33.3%(1/3)胚胎性癌細(xì)胞AFP陽性，63.6%(7/11)未成熟畸胎瘤可見未成熟腸型腺體AFP陽性。AFP經(jīng)常呈彌漫且強(qiáng)的非特異性著色(特別是在壞死或囊性區(qū)域)，此時(shí)應(yīng)判讀為陰性。

34例卵黃囊瘤中GPC-3陰性6例，弱陽性5例，中等陽性9例，強(qiáng)陽性14例。33.3%(2/6)絨毛膜癌細(xì)胞GPC-3陽性，45.5%(5/11)未成熟畸胎瘤中未成熟神經(jīng)組織GPC-3陽性(表1)。

表1 生殖細(xì)胞腫瘤中HNF1β、AFP、GPC-3的表達(dá)

2.3 卵黃囊瘤中HNF1β、AFP及GPC-3表達(dá)的相關(guān)性分析34例卵黃囊瘤中HNF1β的敏感性高達(dá)100%，高于AFP(91.2%)及GPC-3(82.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。HNF1β的表達(dá)與患者性別(P=0.112)、年齡(P=0.274)均無關(guān)。HNF1β的特異性為98%，高于AFP(84.9%)及GPC-3(87.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。HNF1β比AFP具有更高的敏感性，比GPC-3具有更高的特異性。

3 討論

WHO(2020)女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類提出了卵黃囊瘤有11種生長(zhǎng)方式，組織學(xué)形態(tài)的多樣給診斷帶來困難。在混合型生殖細(xì)胞腫瘤中卵黃囊瘤成分較少或與其他生殖細(xì)胞腫瘤的組織學(xué)形態(tài)有重疊時(shí)極易漏診及誤診，不同成分的正確診斷對(duì)患者進(jìn)一步的治療及預(yù)后判斷有重要意義。因此，區(qū)分卵黃囊瘤與其他腫瘤顯得尤其重要。

AFP、GPC-3是臨床診斷卵黃囊瘤常用的標(biāo)志物[11]。AFP是白蛋白基因超家族成員，是一種由原始卵黃囊及次級(jí)卵黃囊產(chǎn)生的早期蛋白[12]，出生后幾乎不再合成。但AFP在肝臟等病變中也能檢測(cè)及[13]，免疫組化染色顯示胞質(zhì)著色，判讀時(shí)易出現(xiàn)假陽性。有研究發(fā)現(xiàn)，在卵黃囊瘤的診斷中GPC-3是一種比AFP更特異的標(biāo)志物[14]，但與AFP相似，GPC-3也可在其他非生殖細(xì)胞腫瘤中表達(dá)[15]。本組34例卵黃囊瘤中HNF1β僅在成熟性畸胎瘤部分分化成熟的成分(胃腸道和胰腺分化)中陽性，在未成熟成分中陰性。GPC-3可在未成熟神經(jīng)外胚層(胚泡和神經(jīng)管)中陽性，AFP也可在未成熟腸型腺體中陽性[16]，并且在未成熟畸胎瘤伴肝樣分化患者的血清中檢測(cè)到AFP表達(dá)水平升高[17]。因此，當(dāng)出現(xiàn)未成熟畸胎瘤混合少許卵黃囊瘤成分時(shí)，易誤診或漏診，而使用免疫組化標(biāo)記HNF1β可以提高診斷的正確率。

肝細(xì)胞核因子(HNFs)是一組轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)肝臟特異性基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[18]。這些轉(zhuǎn)錄因子并不局限于肝臟，亦可表達(dá)于其他組織。目前已知HNFs由4個(gè)不同的家族組成。HNF1α、HNF1β屬于HNF1家族，具有共同的POU同源結(jié)構(gòu)域，以同源二聚體的方式與DNA結(jié)合[18]，在原腸胚開始形成時(shí)，HNF1β最先在內(nèi)胚層被檢測(cè)及。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HNF1β在所有卵黃囊瘤成分中均陽性，敏感性為100%，表現(xiàn)為彌漫核陽性，同時(shí)HNF1β在分化成熟的腸型腺體及胰腺腺泡中呈核陽性。但不同組織學(xué)形態(tài)的卵黃囊瘤中HNF1β的表達(dá)略有不同，如在黏液瘤樣型中陽性率最弱，在內(nèi)胚竇樣結(jié)構(gòu)、乳頭狀及實(shí)性等結(jié)構(gòu)中表達(dá)較強(qiáng)?；煂?duì)HNF1β的表達(dá)影響較小，化療前后的卵黃囊瘤成分HNF1β均呈彌漫核陽性。本組有1例原病理診斷不排除胚胎性癌或者卵黃囊瘤，因組織成分較少且AFP陰性，未做出明確診斷。但回顧性分析發(fā)現(xiàn)，卵黃囊瘤成分呈HNF1β彌漫核陽性，能較好的識(shí)別出不明顯的卵黃囊瘤成分。HNF1β呈細(xì)胞核染色，相比AFP及GPC-3的胞質(zhì)染色更易識(shí)別，且更容易對(duì)微小病灶進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中HNF1β的特異性高達(dá)98%，雖然成熟性畸胎瘤中分化成熟的消化道黏膜及胰腺中HNF1β陽性，但因其形態(tài)即可識(shí)別，因此不會(huì)誤診。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HNF1β比AFP具有更高的敏感性，比GPC-3具有更高的特異性。相較于以往研究，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展了腫瘤的發(fā)病部位，而不局限于睪丸，并對(duì)比兩種日常工作中使用的標(biāo)志物AFP、GPC-3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HNF1β在多個(gè)系統(tǒng)的卵黃囊瘤中均有較好的敏感性及特異性。因此，在卵黃囊瘤的診斷工作中，聯(lián)合使用HNF1β的免疫組化染色，可以提高診斷陽性率。

綜上，本實(shí)驗(yàn)基于全身多個(gè)部位卵黃囊瘤的樣本分析，發(fā)現(xiàn)HNF1β是卵黃囊瘤高度敏感及特異的標(biāo)志物，在卵黃囊瘤的診斷及鑒別診斷中具有重要的意義，值得推廣使用。