腦脊液中D-Ser對齒狀回顆粒細(xì)胞層突觸傳遞和可塑性相關(guān)蛋白的作用研究

謝奇辰，殷衛(wèi)東，錢天秀，陳思維，王曉英

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理中心，北京 100193;2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈 陽 110016;3.山東淄博臨淄區(qū)人民醫(yī)院，山東 淄博 255400)

包繞大腦的腦脊液中富含各種神經(jīng)遞質(zhì)，由于腦內(nèi)神經(jīng)元胞外液與腦脊液互相的交換和交流，所以腦脊液幾乎含有所有大腦調(diào)節(jié)物質(zhì)，成為大腦調(diào)節(jié)物質(zhì)分泌、傳輸、交流的場所。近年來，由于D-Ser在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞對話聯(lián)系中擔(dān)任重要角色而成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。大量研究證實，D-Ser是NMDA受體甘氨酸位點的內(nèi)源性配基，由L-Ser經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞富含的絲氨酸消旋酶產(chǎn)生而來［1－3］。臨床研究也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)精神病人如精神分裂病人以及老年癡呆病人腦脊液中的D-Ser濃度與正常人水平具有明顯差別，所以深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)中D-Ser的功能作用對于神經(jīng)精神相關(guān)疾病病理機(jī)制的研究以及藥物發(fā)現(xiàn)具有重要理論意義。

1 材料與方法

1.1 動物和手術(shù) ♂ SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，單籠飼養(yǎng)(光照:07∶00～19∶00 h)。動物以苯巴比妥鈉(60 mg·kg－1，ip)。麻醉后，固定于離體定位儀，進(jìn)行側(cè)腦室定位，打孔，種植給藥婁管。同時另鉆孔以3個小螺絲將其固定，以牙托粉固定。3 d后，隔天進(jìn)行 IgG 2.5 g·L－1和 anti-D-Ser IgG 2.5 g·L－1(購自 United States Biological)注射，注射 3次后，動物進(jìn)行電生理測定和蛋白表達(dá)測定。

1.2 實驗儀器 VC-11記憶示波器 (Nihon Koden，日本);SEN-7203三道電子刺激器(Nihon Koden，日本);SS-202 J刺激隔離器(Nihon Koden，日本);SR-6N立體定位儀 (Narishige，日本)。

1.3 電生理測定［4］最后1次Anti-D-Ser IgG注射后2 h，以烏拉坦麻醉大鼠(1.5 g·kg－1，ip)，固定于離體定位儀，以同樣的方法埋植刺激電極和記錄電極。刺激電極定位坐標(biāo)為:P 7.5－7.8，L 4.4－4.6，H 3.5－4.0;記錄電極坐標(biāo)為:AP 3.7－4.0，L 2.4－2.7，H 3.0－3.5。根據(jù)已定位坐標(biāo)的位置，將給藥簍管及記錄電極放入所在腦區(qū)。以固定強(qiáng)度的刺激記錄慢慢調(diào)整刺激和記錄電極的位置，直到誘導(dǎo)出最大群峰電位。而后給予不同強(qiáng)度的電刺激，記錄誘發(fā)的動作電位，得到輸入輸出曲線。刺激(0.033 Hz，100 μs)電流強(qiáng)度以引起最大興奮性突觸后電位的1/2－1/3為檢測刺激強(qiáng)度，之后將電極固定。以高頻刺激(HFS，100 Hz，100 μs，10 串，5 個刺激方波，串間隔刺激為200 ms)，誘導(dǎo)LTP刺激強(qiáng)度與測試刺激相同。

1.4 誘發(fā)電位的記錄和幅值的計算方法 實驗中以PS幅度相對值(%)為觀測指標(biāo)，觀察其給藥后的增幅情況。將給藥前30 min所記錄的6個時間點PS幅度值的平均值作為自身基礎(chǔ)突觸傳遞水平(自身基礎(chǔ)幅值)，并以此PS均值為100%。用給藥后所測各時間點的PS幅度值除以基線的6個時間點的PS平均值，得到各時間點的PS幅度相對值。

1.6 Western blot檢測和抗體 Western blot操作流程如前所述進(jìn)行操作［5－6］。大概步驟如下，將皮層、海馬在預(yù)冷的RIPA緩沖液中(1%Igepal CA-630，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS，1 mmol·L－1PMSF，10 g·L－1aprotinin，1 mmol·L－1sodium orthovanadate in PBS buffer，pH 7.4)超聲勻漿，以BCA測定試劑盒檢測蛋白濃度，勻漿液以2x SDS-PAGE上樣緩沖液稀釋至2 g·L－1，樣本蛋白進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF(Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)膜。PVDF膜與溶于含有5%脫脂奶粉的PBS緩沖液的一抗在4℃孵育通宵。各一抗?jié)舛热缦?GAP43(1∶4 000，購自美國Cell Signaling Technology)，Synapsin Ⅰ，MAP2(1 ∶700，購自美國 Cell Signaling Technology)。而后，膜以PBS進(jìn)行3次震蕩沖洗，與二抗1∶5 000室溫孵育60 min，同樣進(jìn)行沖洗后，以ECL顯色法進(jìn)行沖洗(購自Pierce Biotechnology)，條帶以NIH imagine進(jìn)行半定量分析。

Fig 1 Baseline of PS amplitude in perforant path-dentate gyrus synapse(±s，n=5)

2 結(jié)果

2.1 腦脊液中D-Ser對齒狀回顆粒細(xì)胞層突觸傳遞的影響 如 Fig 1所示，在測試刺激(0.033 Hz，100 μs)下，對照組 PS 幅度在 10、30、60、90 min 分別是(103.2±8.6)%、(97.6±7.6)%、(100.5±8.2)%、(97.3±7.3)%，anti-D-Ser組的PS幅度分別為(99.8±7.2)%、(95.6±7.4)%、(103.2±9.6)%、(102.5±8.7)%。對照組和 anti-D-Ser組的基礎(chǔ)突觸傳遞至90 min時沒有明顯變化，呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。

HFS(100 Hz，100 μs)高頻刺激后，在 10、30、60 min的 PS幅度為(182.4±15.1)%、(175% ±13.5)%、(177.8±15.6)%，相比較而言，高頻刺激后10、30、60、90 min 后 Anti-D-Ser組的 PS 幅度分別為(112.3±9.8)%、(120.3±12.0)%、(118.3±13.6)%。anti-D-Ser組PS幅度下降，anti-D-Ser IgG抑制了齒狀回LTP的誘導(dǎo)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of anti-D-Ser IgG on efficacy of synaptictransmission in perforant path-dentate gyrus synapses(±s，n=5)

2.2 腦脊液中D-Ser對突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如Fig 3～5所示，大鼠皮層和海馬部位用于檢測抗D-Ser IgG注射后蛋白表達(dá)的變化以觀察腦脊液中D-Ser對突觸可塑性的影響?？笵-Ser IgG使皮層的GAP-43表達(dá)升高約52%，海馬部位約58%。而抗D-Ser IgG組皮層MAP2的表達(dá)降低約32%，海馬降低約59%。抗D-Ser IgG使皮層的synapsinⅠ表達(dá)降低約45%，海馬部位降低約57%。結(jié)果顯示了抗D-Ser IgG注射后MAP2和SynapsinⅠ的表達(dá)在海馬和皮層均下降，而且海馬MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表達(dá)對腦脊液中D-Ser濃度的變化較皮層更為敏感。

Fig 3 Western blot of GAP-43 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 4 Western blot of MAP2 expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

Fig 5 Western blot of Synapsin I expression in control and anti-D-Ser IgG-treated rat brain(±s，n=5)

3 討論

我們曾驗證了腦脊液中物質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能具有調(diào)節(jié)作用，如慢性ET-1免疫球蛋白注射可調(diào)節(jié)內(nèi)源性鴉片系統(tǒng)［5－6］。包繞大腦的腦脊液中富含各種神經(jīng)遞質(zhì)，由于腦內(nèi)神經(jīng)元胞外液與腦脊液的互相交通，腦脊液幾乎含有所有大腦調(diào)節(jié)物質(zhì)，包括氨基酸。所以腦脊液提供了一個大腦調(diào)節(jié)物質(zhì)分泌、傳輸、交流的場所。有研究表明，中樞神經(jīng)精神相關(guān)疾病患者腦脊液中某些蛋白的參數(shù)會發(fā)生明顯改變，Hashimoto等［7］報道臨床精神病患者腦脊液中的D-Ser水平明顯下降，D'Aniello等［8］發(fā)現(xiàn)老年癡呆病人腦脊液中的兩種氨基酸呈現(xiàn)出明顯變化。Bendikov等［9］報道了D-Ser濃度明顯影響了精神病病人的臨床癥狀。我們在前期工作的基礎(chǔ)上［4－5］，以抗D-Ser IgG進(jìn)行中樞注射，降低腦脊液中的 DSer水平，來反向推測D-Ser在其中的作用。結(jié)果表明抗D-Ser IgG明顯阻礙了齒狀回顆粒細(xì)胞層LTP的誘導(dǎo)，本研究所進(jìn)行的在體實驗的結(jié)果與Henneberger等所報道的離體實驗的研究結(jié)果相吻合［10－11］，同時海馬和皮層部位的突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生了明顯的變化。突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)為突觸形態(tài)變化的內(nèi)在機(jī)制，如生長相關(guān)蛋白GAP-43、微管相關(guān)蛋白MAP-2以及突觸素synapsinⅠ。MAP2存在于神經(jīng)元的胞體、樹突和樹突棘，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架、突起生長、胞質(zhì)蛋白運(yùn)輸、神經(jīng)元塑形等功能，其丟失涉及到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙?？笵-Ser IgG使皮層和海馬的MAP2表達(dá)降低。突觸素synapsinⅠ特異性定位于軸突終末的突觸囊泡膜上，反映軸突終末結(jié)構(gòu)的分布［12］。synapsinⅠ的改變可能引發(fā)多種神經(jīng)精神障礙，它通過磷酸化與去磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與突觸發(fā)育，是突觸功能的物質(zhì)基礎(chǔ)［13－14］?？笵-Ser IgG使皮層和海馬synapsinⅠ表達(dá)降低，同MAP2的變化一致。臨床發(fā)現(xiàn)精神病人腦脊液中的D-Ser水平明顯下降，病人死后檢測結(jié)果表明其海馬的 MAP-2表達(dá)亦呈明顯性下降［15－16］，這同本研究的結(jié)果相吻合。

有趣的是我們發(fā)現(xiàn)海馬MAP2和SynapsinⅠ蛋白的表達(dá)對腦脊液中D-Ser濃度的變化表現(xiàn)出更高的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)中樞注射抗D-Ser IgG后，海馬部位的MAP2和synapsisⅠ蛋白表達(dá)的變化較皮層更為敏感。這涉及到一個中樞抗體注射后的擴(kuò)散均勻度和作用是否徹底的問題，也即抗體進(jìn)入后是通過局部擴(kuò)散滲透到腦組織中作用還是通過腦脊液進(jìn)行作用，也曾有報道認(rèn)為IgG進(jìn)入側(cè)腦室后會不能均勻分布［17］，我們曾就此進(jìn)行了專門的驗證［5－6］，我們采用了大腦勻漿進(jìn)行檢測，并沒有發(fā)現(xiàn)殘留的IgG，也沒有發(fā)現(xiàn)皮層或海馬部位殘留的IgG。結(jié)果表明抗D-Ser IgG通過側(cè)腦室進(jìn)入中樞后，進(jìn)行了有效的全腦作用，與學(xué)習(xí)記憶能力有密切關(guān)系的海馬對D-Ser水平的變化更為敏感。

相比之下，GAP-43蛋白的表達(dá)在海馬和皮層均呈上升趨勢，GAP-43主要分布于生長錐和突觸前末端，可促進(jìn)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、神經(jīng)再生及突觸重建。在生長錐，GAP-43可促進(jìn)F-肌動蛋白的聚集，使生長錐在形態(tài)上更具活力，并抵抗其回縮。我們推斷GAP43表達(dá)的增加是由在抗D-Ser IgG進(jìn)入中樞后所導(dǎo)致的突觸傳遞的障礙所引起的蛋白表達(dá)的負(fù)反饋反應(yīng)所致。Rekart和Chambers等也報道了相似的臨床檢驗結(jié)果，老年癡呆患者死后解剖分析結(jié)果顯示伴隨著D-Ser水平的降低，其GAP-43在海馬腔隙分子層，以及精神分裂病人的門區(qū)，內(nèi)分子層的表達(dá)升高［18－19］，本研究結(jié)果與臨床研究的新發(fā)現(xiàn)是相吻合的。

總之，研究結(jié)果表明腦脊液中D-Ser具有重要的中樞調(diào)節(jié)作用，這對精神分裂病人和老年癡呆患者的臨床治療新藥物和治療方法的發(fā)現(xiàn)提供了理論支持。

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