2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的合成、表征及其應(yīng)用

唐偉偉，王俊平，王碩

（教育部食品與營養(yǎng)重點實驗室天津科技大學，天津 300457）

2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的合成、表征及其應(yīng)用

唐偉偉，王俊平，王碩*

（教育部食品與營養(yǎng)重點實驗室天津科技大學，天津 300457）

以甲巰咪唑和溴乙酸為原料，合成了2-S-羧甲基-1-甲基咪唑，并對其進行MS和1H NMR驗證，然后以此化合物作為半抗原來合成甲巰咪唑酶標記抗原，然后利用分子印跡技術(shù)在酶標板上直接聚合制備仿生抗體，最后利用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法測定豬肉樣品中甲巰咪唑的殘留。2-S-羧甲基-1-甲基咪唑的產(chǎn)率為73.8%～95%，IC50和IC15分別為（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L豬肉樣品中的甲巰咪唑回收率為77%～89%。且測定結(jié)果與HPLC方法具有良好的一致性。

甲巰咪唑；溴乙酸；表征；酶標抗原；仿生酶聯(lián)免疫

甲巰咪唑有增進蛋白質(zhì)代謝、提高瘦肉率的作用，因此會被不法者添加到動物飼料中，動物經(jīng)此類飼料飼喂后在尿液、肌肉及組織中會有不同程度的殘留。人在食用了殘留有甲巰咪唑的動物性食品后會造成甲巰咪唑在人體內(nèi)的蓄積，從而產(chǎn)生蓄積毒性作用如膜性腎病、急性造血功能停滯[1]。

現(xiàn)在檢測甲巰咪唑的方法有薄層色譜法（TLC）[2]，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3-4]，高效液相色譜法（HPLC-UV）[5-7]，質(zhì)譜法（MS）[8]、毛細管電泳法（CE）[9-10]和分子印跡法[11]。但是還鮮見利用酶聯(lián)免疫吸附測定法來檢測動物源性食品中殘留的甲巰咪唑的報道。利用酶聯(lián)免疫吸附法最重要的一點就是半抗原的合成，然后進一步合成酶標抗原和免疫原。然而合成甲巰咪唑半抗原的報道并沒有見到。眾所周知，半抗原與載體蛋白連接必須有3個基本條件：半抗原的化學結(jié)構(gòu)上必須帶游離氨基或游離羧基或者二種基團皆有，本文研究用活化酯法合成甲巰咪唑酶標抗原所需要的半抗原的兩種合成方法。合成機理見圖1。

圖1 2-S羧甲基-1-甲基咪唑合成路線Fig.1 Reaction scheme for the synthesis of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

旋蒸儀：瑞典Buchi公司；SHB-IV型雙A循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；BL-610分析天平：美國Sartorius公司；AV-400核磁共振儀：布魯克公司；LCQ Advantage液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo公司。

溴乙酸：國藥集團（上海）化學試劑有限公司；甲巰咪唑：99.7%，北京燕京藥業(yè)有限公司；濃鹽酸：北京化工廠；氫化鈉：天津市北斗星精細化工有限公司；氫氧化鈉：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；四氫呋喃：色譜純，德國Merck公司；甲醇：色譜純，天津康科德公司。

試驗前先將四氫呋喃做脫水處理。

1.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的制備

甲巰咪唑的分子結(jié)構(gòu)上具有一個-CH3和一個-SH，本試驗擬用溴乙酸與甲巰咪唑的巰基反應(yīng)，接上一個游離羧基的臂，即合成出了2-S羧甲基-1-甲基咪唑。

1.2.1 方法一

稱取5 g NaOH溶于40 mL水中，然后加入6.85 g甲巰咪唑，磁力攪拌15 min。15 min后，加入9 g溴乙酸，回流2 h。

待回流裝置冷卻后，用濃鹽酸將回流后的液體酸化至pH=1，然后加入等體積的乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，收集有機相40℃減壓旋蒸，最終得到紅色油狀物質(zhì)，TLC（乙酸乙酯:甲醇=5:2），Rf=0.7。柱層析收集后面的成分，再40℃減壓旋蒸，最終得到紅色固體。收率為73.8%。

1.2.2 方法二

用分析天平準確稱取5.71 g甲巰咪唑，然后將其溶解于裝有20 mL重蒸四氫呋喃的圓底燒瓶中，再稱取1.875 g氫化鈉（NaH與甲巰咪唑的摩爾比為1:1.5），多次少量將NaH加入到甲巰咪唑的四氫呋喃溶液中，會發(fā)現(xiàn)有大量氣泡產(chǎn)生，并且產(chǎn)生很多的熱量，故此過程要在冰浴中進行。

再稱取7.5 g溴乙酸溶解于2 mL重蒸四氫呋喃中，逐滴加入到上述圓底燒瓶中，最后加雙蒸水將上述固體溶解，用濃鹽酸調(diào)pH至1，加入等量的乙酸乙酯萃取，萃取3次。收集有機相，40℃減壓旋蒸，最終得到紅色的半抗原，收率為95%。

1.3 酶標抗原的制備

取一個25 mL的圓底燒瓶,稱取0.102 g半抗原，溶解于2.76 mL DMF中，再稱取0.068 g N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）加入圓底燒瓶中。然后再稱取0.248 g N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），用最少量的二甲基亞砜（DMF）將其溶解，在氮氣保護的情況下，一滴一滴向圓底燒瓶中加入DCC溶液，最后在氮氣保護的情況下避光反應(yīng)過夜。

24 h后離心，除去反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物1，3-二環(huán)乙基脲（DCU），取上清液。

用分析天平準確稱取10.0 mg辣根過氧化酶（HRP），溶于2 mL 50 mmol/L的 K2HPO4緩沖液（pH=9.3）中。用微量移液器量取適量的上清液，緩慢滴加到上述酶溶液中，直至蛋白溶液出現(xiàn)輕微混濁，每滴加一次輕搖1 min左右，此過程要在冰浴中進行。將混合液放入4℃冷藏柜攪拌過夜，取出后在室溫下用PBS攪拌放置1 h～2 h。

1 h～2 h以后，先將透析袋用去離子水潤洗，用透析夾夾住一頭兒，再將酶標抗原溶液裝入透析袋中，用2 L磷酸鹽緩沖液PBS溶液透析，每天換3次透析液，連續(xù)透析3 d。3 d后將透析袋取出，準確量取透析袋中酶標抗原溶液的體積，再加入等體積的甘油，放于-20℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶標抗原稀釋度的優(yōu)化

抗體是分子印跡聚合物膜，是以甲巰咪唑為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，直接在96孔酶標板上直接聚合，然后用甲醇:冰乙酸=3:1的洗脫液將模板分子甲巰咪唑超聲洗脫。

將連接好的酶標抗原原液從1:500開始進行3倍梯度稀釋，每孔加入100 μL酶標稀釋液，室溫孵育1 h。1 h后棄去酶標稀釋液，用PBST洗板5次。每孔再加入150 μL底物顯色液，顯色30 min。30 min后每孔加入50 μL終止液。每孔吸出150 μL顯色后的溶液立即在雙波長方式（450 nm～650 nm）下用酶標儀讀取吸光度值讀數(shù)。選擇對應(yīng)的吸光度值在1.2～1.4之間的酶標稀釋度就是后續(xù)直接競爭反應(yīng)所用的酶標溶液稀釋倍數(shù)。

1.5 直接競爭ELISA方法操作步驟

在直接聚合的酶標板上，每孔先加入100 μL甲巰咪唑標樣溶液或樣品提取液，然后立即加入100 μL酶標抗原溶液，以不加甲巰咪唑標樣的孔為對照孔，室溫孵育1 h，然后棄去上清液，用PBST洗液洗板5次。在每孔中加入150 μL底物顯色液，室溫下反應(yīng)30 min。每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在雙波長方式（450 nm～650 nm）下用酶標儀讀取吸光度值。

1.6 ELISA標準曲線的建立

準確稱取甲巰咪唑標準品配制成1000 mg/L甲醇貯備液，將其用5%甲醇-PBS稀釋至60 mg/L，再依次10 倍稀釋至 6000，600，60，6和 0.6 μg/L 標準溶液。按照1.5的方法得到一系列濃度標準溶液的吸光度值。

按照下式計算不同濃度甲巰咪唑?qū)乖贵w結(jié)合反應(yīng)的抑制率值：

式中：IC%為甲巰咪唑?qū)乖贵w結(jié)合反應(yīng)的抑制率；A對照為450 nm吸光值與650 nm吸光值的差值；A樣品為甲巰咪唑標準液或樣液的平均吸光度值；A空白為不加入酶標及甲巰咪唑標準液的平均吸光度值。

繪制標準曲線：以抑制率為縱坐標，甲巰咪唑濃度對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線。每次試驗均應(yīng)重新繪制標準曲線。

1.7 樣品的準備、添加回收試驗和液相驗證

稱取5.00 g豬肉樣品于50 mL離心管中，50、100、150 μL甲巰咪唑標準溶液（濃度為1 mg/L），黑暗放置15 min。然后加入25 mL乙腈和1 mL 4 mol/L碳酸鉀溶液（除去豬肉中的蛋白質(zhì)），漩渦振蕩2 min，在4℃下3500 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)至分液漏斗中，殘渣用同樣方法再提取一次，合并上清液。分液漏斗中加入50 mL乙腈飽和的正己烷，液液萃取2 min除去脂肪，靜置分層后除去正己烷相，重復萃取三次。乙腈相中加入50 mL飽和氯化鈉溶液，使其乳化現(xiàn)象減小，液液萃取2 min后分離乙腈相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，用2 mL乙腈洗滌無水硫酸鈉，合并濾液于雞心瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用1 mL 5%甲醇-PBS溶液復溶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

液相色譜條件為：色譜柱采用反相Thermo C18反相柱（4.6 mm×150 mm,USA）。紫外檢測器，檢測波長：254 nm；直接進樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃。采用色譜峰的保留時間定性，外標法峰面積定量。流動相為:甲醇/水（10:90，v/v）。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征

2-S羧甲基-1甲基咪唑MS表征見圖2。

由于接到甲巰咪唑結(jié)構(gòu)上的是一個-CH2COOH，在負離子出峰，反應(yīng)之前甲巰咪唑分子量是114，反應(yīng)之后分子量是172，由圖2可以看出在負離子出現(xiàn)一個比較高的171峰，即為2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量減去一個H，而342是2-S羧甲基-1-甲基咪唑的分子量減去一個H的二倍體，從圖2可以看出合成出的成品是純度比較高的。

圖2 2-S羧甲基-1甲基咪唑的MS圖Fig.2 Mass Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

2.2 2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征

2-S羧甲基-1-甲基咪唑的1H NMR表征見圖3。

圖3 2-S羧甲基-1甲基咪唑1H RNM表征Fig.3 1H NMR Spectrogram of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

氫譜以氘代乙腈為溶劑，在1H NMR圖中，δ4.626～4.641（δ為化學位移，代表譜峰位置）之間是咪唑環(huán)上兩個氫的共振峰。根據(jù)峰面積來看，δ4.134處是甲巰咪唑上的-CH3的共振峰。在甲巰咪唑巰基臂上后接的與-COOH相連的-CH2-在δ3.906處出現(xiàn)單峰，而在化學位移δ4.266是-COOH上氫質(zhì)子的共振峰。

2.3 酶標稀釋度的優(yōu)化

對酶標稀釋度優(yōu)化的結(jié)果見表1。

表1 不同濃度的酶標的吸光度值Table 1 The OD of Methimazole-HRP in Different Concentration

由表1可以看出不同濃度的酶標濃度有顏色梯度的變化，證明了辣根過氧化酶-HRP成功接到了甲巰咪唑半抗原上。酶標最優(yōu)稀釋度為1:1500。

2.4 ELISA標準曲線

ELISA標準曲線見圖4。

圖4 甲巰咪唑仿生酶聯(lián)免疫標準曲線Fig.4 Methimazole BELISA standard curves

從圖4可以看出，以制備的分子印跡聚合物膜作為仿生抗體時，甲巰咪唑能與酶標記甲巰咪唑競爭吸附印跡膜的識別位點，產(chǎn)生明顯地競爭效應(yīng)，60 mg/L時抑制率可達到71%。在最適反應(yīng)條件下，建立的直接競爭BELISA方法測定甲巰咪唑ELISA的靈敏度為100 μg/L，最低檢測限為 1.1 μg/L。

2.5 實際樣品的測定

為了驗證所建立的BELISA方法在實際樣品測定中的應(yīng)用，50、100、150 μL 濃度為 1 mg/L 的甲巰咪唑標準溶液分別添加到5.00 g豬肉樣品中，然后采用直接競爭BELISA方法檢測，結(jié)果見表2。

表2 直接競爭ELISA與液相色譜方法對豬肉樣品中添加回收甲巰咪唑的結(jié)果分析Table 2 Analysis Results of Spiked methimazole in pork samples by the developed BELISA and HPLC methods(Mean(S.D.,n=3)μg/kg

3 結(jié)論

從對合成出的產(chǎn)物的MS，1H NMR表征來看，證明了甲巰咪唑的-SH先與NaH或者NaOH發(fā)生反應(yīng)，然后在與BrCH2COOH發(fā)生反應(yīng)這一設(shè)計路線是可行的，但是利用NaOH合成出的產(chǎn)品需要進行柱層析純化，而利用NaH合成出的產(chǎn)品純度很高，不需要后期的純化工作。合成出酶標抗原以后，對酶標稀釋度進行了優(yōu)化，酶標記抗原顯色有梯度的變化，表明酶標記抗原連接成功。在仿生酶聯(lián)免疫分析方法的測定中，靈敏度和最低檢出限分別為（100±4）μg/L和（1.1±0.04）μg/L。在豬肉樣品中，甲巰咪唑的添加回收率為77%～89%，且測定結(jié)果與HPLC具有良好的一致性。

對于甲巰咪唑在動物性食品中的殘留量的檢測方法有很多，但是用酶聯(lián)免疫吸附測定法來檢測甲巰咪唑的殘留很少，本文采用的是以分子印跡技術(shù)在96-孔酶標板上直接聚合制備出仿生抗體，然后采用直接競爭方法來檢測。以上酶標記抗原連接方法的合成也為用傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis，Application and Characterization of 2-S-carboxymethyl-1-methyl Iminazole

TANG Wei-wei,WANG Jun-ping,WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education of China,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Methimazole can promote the metabolism of protein,it had been applied illegally to animals'feed to obtain more lean meat.It has serious health implications to people.There was no report about using artificial antibody of ELISA to monitor methimazole.2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was synthesized with methimazole and bromoacetic acid,it was used as hepten in Enzyme-Linked Immunosorbent Assay method.The product was characterized by MS and1H NMR.And then the Ag-HRP was synthesized.The production of 2-S-carboxymethyl-1-methyl iminazole was 73.8%-95%.The IC50and the detection limit values under optimized experimental condition were(100±4)μg/L and(1.1±0.04)μg/L,respectively.Good recoveries have ranged from 77%-89%,respectively.It had a good agreement for methimazole in comparative analysis with that using HPLC.

methimazole;bromoacetic acid;characterization;Ag-HRP;BELISA

天津自然科學基金（09JCYBJC14300）

唐偉偉（1986—），女（回），在讀碩士研究生，主要研究方向：食品安全檢測。

*通信作者

2011-12-22