靈芝多糖清除自由基活性的研究

張志軍，李淑芳，魏雪生

（天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300112）

靈芝（Ganoderma Lucidum）在我國(guó)自古就有“仙草”的美譽(yù)，已有悠久的藥用和食用歷史，如《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載[1]。多糖是靈芝中具有生物活性的主要有效組分之一。20世紀(jì)70年代以來(lái)，靈芝多糖的研究開(kāi)發(fā)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展時(shí)期，經(jīng)過(guò)近30年的發(fā)展，人們對(duì)靈芝多糖這一類(lèi)重要生命物質(zhì)產(chǎn)生了新的認(rèn)識(shí)[2]。據(jù)報(bào)道，從雙孢蘑菇、靈芝、香菇、側(cè)耳等6種真菌中提取出的活性成分，可以防止細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷。劉志峰等的研究證明，蘑菇提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率可達(dá)29%。真菌提取物對(duì)自由基有一定的清除作用[3]。真菌是自由基清除劑的良好載體。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，國(guó)內(nèi)外基本上采用水浸法、堿浸法提取多糖，再經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀提純。由于傳統(tǒng)工藝采用堿浸、有機(jī)溶劑分離提純等手段，易對(duì)靈芝多糖聚合體造成破壞；對(duì)某些活性基團(tuán)也易造成變性失活，且粗多糖提取效率極低；膜分離技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的，在分子水平上實(shí)現(xiàn)機(jī)械分離的高新技術(shù)。由于它具有常溫操作，無(wú)相態(tài)變化，高效節(jié)能，在生產(chǎn)過(guò)程中不產(chǎn)生污染等特點(diǎn)，且整個(gè)分離過(guò)程在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行，可避免和減輕熱和氧對(duì)物料營(yíng)養(yǎng)成分的影響，因此，膜分離技術(shù)被認(rèn)為是21世紀(jì)最有前途的技術(shù)。因此，采用膜技術(shù)進(jìn)行靈芝多糖的分離純化，不僅收率高而且極少破壞靈芝多糖結(jié)構(gòu)[4]。

因此，本文對(duì)靈芝多糖的還原能力及其對(duì)羥自由基(·OH)和超氧自由基(·O2-)的清除活性進(jìn)行了研究探討,并對(duì)不同工藝制取的靈芝多糖的清除自由基的能力進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝：由天津市林業(yè)果樹(shù)研究所提供；

鄰苯三酚、番紅花T、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純；

恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司；752分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖制取方法

水提醇沉工藝：靈芝子實(shí)體→粉碎→粗濾→真空濃縮→醇沉→干燥

膜分離工藝：靈芝子實(shí)體→粉碎→預(yù)煮→粗濾→微濾→超濾→濃縮干燥

1.2.2 還原能力測(cè)定（鐵氰化鉀還原法）

在2.5 mL pH6.6磷酸緩沖溶液中加入1 mL提取物溶液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合物在50℃恒溫條件下，加熱20 min，急速冷卻，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r/min離心分離，取上層清液2.5 mL，加2.5 mL水再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)吸光度A值。A700越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。

1.2.4 對(duì)超氧陰離子·O2-的清除作用

根據(jù)吳慧平的方法，鄰苯三酚在堿性條件下能發(fā)生自氧化生成有色中間物（在420 nm處有最大吸收峰）和·O2-，·O2-對(duì)自氧化又起催化作用，依據(jù)有色中間物生成量的多少，可判斷·O2-生成量的多少。實(shí)驗(yàn)體系為3 mL Tris-HCl緩沖液（pH8.2）和0.1 mL不同濃度的樣品，25℃水浴20 min后加入3 mL濃度為7 mmol/L的鄰苯三酚，反應(yīng)4 min后加入10 mol/L的HCl終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液作參比，在420 nm處測(cè)OD值。對(duì)照組以0.1 mL蒸餾水代替樣品，空白組以不加鄰苯三酚，根據(jù)清除率判斷樣品對(duì)·O2-生成的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝多糖的還原能力測(cè)定

還原力法的原理為：K3Fe(CN)6+樣品→K4Fe(CN)6+樣品氧化物

在波長(zhǎng)700 nm條件下測(cè)定吸光度A，A越大，則樣品的還原能力越大。

靈芝多糖的抗氧化能力測(cè)定，見(jiàn)表1?？芍?.10mg/mL多糖溶液的A700與水體系A(chǔ)700值相當(dāng)，說(shuō)明該濃度（均指加入反應(yīng)體系的樣品起始濃度，后同）下靈芝多糖沒(méi)有還原能力。其后4個(gè)濃度，隨著濃度的增大，A700值也增大，多糖的還原能力在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有較好的量效關(guān)系。以30μg/mLVC溶液的還原能力作參比，1.00 mg/mL多糖溶液的還原能力強(qiáng)于VC。以相同起始樣品濃度比較A700值，靈芝多糖還原能力明顯低于VC的還原能力，但多糖溶液還原能力的存在說(shuō)明多糖具有表現(xiàn)抗氧化作用的可能性。

表1 靈芝多糖的抗氧化能力測(cè)定Table 1 The determinatiing test of antioxidant activity of Ganoderma Lucidum polysaccharide

2.2 靈芝多糖的清除自由基實(shí)驗(yàn)

自由基產(chǎn)生過(guò)量可以引起生物膜和DNA的氧化性損傷,導(dǎo)致癌癥、動(dòng)脈硬化、衰老和多種老年慢性疾病,如使用生物抗氧化劑切斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以抑制機(jī)體的自由基損傷,從而保持最佳健康狀態(tài)和防治這些疾病,延緩衰老。

多糖可以捕捉脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的活性氧,減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈的長(zhǎng)度，阻斷或減緩脂質(zhì)過(guò)氧化的進(jìn)行。對(duì)于·OH而言，可快速地攫取多糖碳?xì)滏溕系臍湓咏Y(jié)合成水，而多糖的碳原子上則留下一個(gè)成單電子，成為碳自由基，進(jìn)一步氧化形成過(guò)氧自由基，最后分解成對(duì)機(jī)體無(wú)害的產(chǎn)物；對(duì)于·O2-，多糖可與其發(fā)生氧化反應(yīng),達(dá)到清除的目的。

2.2.1 不同提取工藝對(duì)·OH的清除作用

不同提取工藝對(duì)·OH的清除作用見(jiàn)表2。

表2 不同多糖提取工藝對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用Table 2 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·OH

由表2可知，隨著多糖濃度的增加，對(duì)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除率增大，量效關(guān)系非常明顯。在相同濃度下，新工藝多糖清除羥自由基的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)工藝，IC50分別為1.58、1.36。

2.2.2 不同提取工藝對(duì)·O2-的清除作用

不同提取工藝對(duì)·O2-的清除作用見(jiàn)表3。

表3 不同多糖提取工藝對(duì)超氧陰離子（·O2-）的清除作用Table 3 Scavenging effect of Ganoderma Lucidum polysaccharide by different extraction technology on·O2-

由表3可知，隨著多糖濃度的增加，對(duì)鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除率增大，且量效關(guān)系非常明顯。在相同濃度下，新工藝多糖清除超氧陰離子的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)工藝，IC50分別為2.83、2.55。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，新工藝制取的靈芝多糖的清除自由基的能力強(qiáng)于傳統(tǒng)工藝，這是因?yàn)?，在靈芝多糖的制取過(guò)程中，傳統(tǒng)工藝采用了有機(jī)溶劑和多次高溫處理，使多糖的生物活性受到影響的緣故。

3 結(jié)論

1）靈芝多糖濃度在0.1 mg/mL時(shí)，A700與水體系相當(dāng)，基本沒(méi)有還原能力；在1.0 mg/mL時(shí)，多糖溶液的還原能力強(qiáng)于30 ug/mL的VC溶液；由多糖溶液的還原能力的存在說(shuō)明多糖具有抗氧化作用的可能性。

2）對(duì)不同制取工藝的靈芝多糖的清除自由基能力進(jìn)行比較，結(jié)果表明，膜分離工藝制取的靈芝多糖清除超氧陰離子·O2-和羥自由基·OH的能力均較好，并且清除能力和多糖的濃度存在明顯的量效關(guān)系。

[1]馬禮金.靈芝的藥用及食用研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000，24(1)：62-66

[2]藺麗，方能虎，吳旦，等.靈芝的主要生物活性研究概況[J].中國(guó)食用菌，2000，21(3)：38-40

[3]肖建輝，將儂輝，梁宗琪,等.食藥用真菌多糖研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué)，2002，22（2）：148-151

[4]劉建華，張志軍.靈芝多糖提取與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].保鮮與加工，2003，3（3）：9-10