一株異腸球菌SJR-16-1胞外多糖合成條件的研究

白麗娟，李向東

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436）

一株異腸球菌SJR-16-1胞外多糖合成條件的研究

白麗娟1，李向東2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436）

針對(duì)分離自內(nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)馬奶酒中的41株乳酸菌進(jìn)行胞外多糖生物合成能力的的研究，篩選出一株胞外多糖產(chǎn)量高的菌株異腸球菌SJR-16-1，分別改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源、氮源以及發(fā)酵溫度、時(shí)間、pH等條件，探討其對(duì)異腸球菌SJR-16-1胞外多糖生物合成能力的影響。優(yōu)化的培養(yǎng)基的組成為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O 0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。確定其胞外多糖的最佳生物合成條件為：初始pH6.0，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間14 h，優(yōu)化的條件顯著提高了EPS的合成量。

異腸球菌；胞外多糖；生物合成

馬奶酒（Kummis）是以鮮馬奶為原料，加入含有乳酸菌、酵母菌等菌種的發(fā)酵劑，經(jīng)科學(xué)方法釀制而成的活性乳飲料，在醫(yī)療保健作用方面，馬奶酒具有驅(qū)寒、活血、舒筋、消食、健胃等功能[1]。

乳酸菌 (lactic acid bacterium，LAB)的胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是這類細(xì)菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的黏液或莢膜多糖[2-3]。

乳酸菌胞外多糖可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、起泡劑和凝膠劑應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域。但是產(chǎn)量低、成本高，菌株穩(wěn)定性差是影響其廣泛應(yīng)用的主要因素。影響乳酸菌EPS生物合成的因素很多，而且不同乳酸菌EPS的最適生物合成條件差異較大。乳酸菌EPS生物合成除受遺傳因素即菌株自身因素的影響外，還受培養(yǎng)基的組成、pH，培養(yǎng)溫度、金屬元素(Mg、Mn、Fe)、氨基酸、黃嘌呤和恒定的氧壓濃度等因素的影響[4]。EPS產(chǎn)量的遺傳不穩(wěn)定性在工業(yè)應(yīng)用上是一個(gè)較大的問題，己有研究報(bào)道了乳酸菌EPS生產(chǎn)性狀易于丟失、降低或者組成發(fā)生改變。

乳酸菌EPS應(yīng)用于產(chǎn)品的生產(chǎn)成本高要廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域受到限制。為提高乳酸菌EPS的生物合成量，EPS合成機(jī)制、合成的遺傳調(diào)控、高產(chǎn)菌株構(gòu)建、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、新型發(fā)酵方法的研究等都是切入點(diǎn)[5]。本文試圖從馬奶酒中分離出的乳酸菌中篩選出合成胞外多糖多的菌種，研究其大量合成胞外多糖的條件、優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高胞外多糖的產(chǎn)量，進(jìn)行后續(xù)研究及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實(shí)驗(yàn)菌株均采于錫林郭勒牧區(qū)的巴彥錫勒等牧場(chǎng)，代號(hào)分別為：BX、LN、MD、AE、SN、SJ以及本課題組保留的菌株。本課題組在前期工作中將馬奶酒發(fā)酵菌初步分離后，菌種凍干保存。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

TPY液體增菌培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、MRS半固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基及脫脂乳培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[6-7]介紹的方法配制。

1.3 方法

1.3.1 胞外多糖高產(chǎn)菌株的篩選及合成條件的研究

將分離保存的41株菌株分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液采用12000 g 4℃離心30 min，收集上清液，減壓濃縮至適當(dāng)體積加3倍95%的冷酒精沉淀24 h，于12000 g(4℃)離心30 min，重復(fù)3次，沉淀物溶解于重蒸水中，并于4℃下透析24 h，濃縮、真空干燥，并采用硫酸-蒽酮法測(cè)定，篩選出合成胞外多糖含量高的菌株鑒定后分別對(duì)碳源、氮源和培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，確定最合乳酸菌胞外多糖合成的條件[8]。

1.3.2 分析

光密度采用721分光光度計(jì)測(cè)定；pH用酸度計(jì)測(cè)定；總糖含量采用硫酸-蒽酮法測(cè)定，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)[9]，活菌數(shù)量用MRS瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬奶酒中乳酸菌合成胞外多糖能力的研究

2.1.1 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌株的篩選

來源于酸馬奶的不同乳酸菌菌株，在11.5%的脫脂牛乳培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)20 h后，凝乳經(jīng)過離心、脫蛋白、乙醇沉淀、透析并采用硫酸—蒽酮法測(cè)定的EPS生物合成量如表1所示。

表1結(jié)果顯示，分離株EPS產(chǎn)量差異顯著，范圍為0.33 mg/L～34.29 mg/L。EPS合成量最高的菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株雙歧桿菌，合成量為34.29 mg/L。除標(biāo)準(zhǔn)菌株外，來源于馬奶酒中的乳酸菌EPS產(chǎn)量最高的菌株是BXE-5-3，其次是 SJR-16-1，其產(chǎn)量是 31.56 mg/L，稍低于BXE-5-3，本項(xiàng)目選取菌株SJR-16-1胞外多糖生物合成條件的研究。

表1 不同乳酸菌株的胞外多糖產(chǎn)量（Mean±SD，n=3）Table1 Exopolysaccharide yield of different strains of lactic acid bacteria

2.1.2 高產(chǎn)EPS菌株的生長曲線

將高產(chǎn)EPS的乳酸菌SJR-16-1接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管各14支，37℃培養(yǎng)，每間隔2小時(shí)取出1支，在600 nm的波長處檢測(cè)光密度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，得到該菌株的生長曲線如圖1所示。

圖1 菌株SJR-16-1在不同時(shí)間培養(yǎng)的生長曲線Fig.1 The growth curve of SJR-16-1 in different times

圖1顯示，乳酸菌SJR-16-1從接種到第4小時(shí)處于延遲期，這期間細(xì)胞數(shù)目變化不大，經(jīng)過適應(yīng)后細(xì)胞生理狀態(tài)逐漸恢復(fù)，并開始生長；從第4小時(shí)到第10小時(shí)為對(duì)數(shù)期，此期間細(xì)胞代謝活躍，生長速度成線性上升，繁殖力強(qiáng)。從第15小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定期，在此期間新繁殖細(xì)胞數(shù)目與死亡的細(xì)胞數(shù)目基本處于平衡的狀態(tài)，活細(xì)菌數(shù)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。微生物的代謝因種而異，受培養(yǎng)基成分及環(huán)境條件的影響，同時(shí)與菌齡、接種量也有關(guān)系。

2.1.3 高產(chǎn)胞外多糖菌株的鑒定結(jié)果

本試驗(yàn)研究中，對(duì)高產(chǎn)EPS乳酸菌菌株SJR-16-1的屬特性鑒定時(shí)，采用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)IFO13597為標(biāo)準(zhǔn)菌株。高產(chǎn)菌株SJR-16-1在，在過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和聯(lián)苯胺反應(yīng)中均為陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在15℃和45℃都生長的革蘭氏陽性菌鑒定為腸球菌屬的細(xì)菌。菌株SJR-16-1除具有乳球菌屬的特征外，在45℃不生長，能在6.5%NaCl環(huán)境中生長，能還原0.1%美蘭，能水解精氨酸，能分解棉籽糖，不分解鼠李糖、甘露醇、木糖、松三糖和蜜二糖等糖類的菌鑒定為異腸球菌。具體鑒定結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸菌SJR-16-1的鑒定結(jié)果Table 2 Result of Lactic acid bacteria SJR-16-1 authenticated

2.2 不同碳源碳源對(duì)異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成的影響

在初始pH 6.5的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源，接種異腸球菌SJR-16-1后置于37℃下發(fā)酵24 h，其pH、OD600nm和EPS的生物合成量如表3所示。

表3 不同碳源對(duì)異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成量的影響（Mean±SD，n=3）Table 3 Effect of various carbon sources on pH,OD600 and EPS produced by SJR-16-1

結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1%葡萄糖和1%麥芽糖，異腸球菌SJR-16-1生長旺盛而且EPS的生物合成量最高為62.68 mg/L。

2.3 不同氮源對(duì)異腸球菌SJR-16-1生長和胞外多糖合成的影響

在初始pH 6.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入2%蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白胨，接種異腸球菌SJR-16-1置于37℃下發(fā)酵24 h后，其pH、OD變化和EPS的生物合成量如表4所示。

表4結(jié)果顯示以蛋白胨作為氮源有利于乳酸菌的增殖和EPS的合成，因此，蛋白胨的添加量分別為20 g/L。

表4 不同氮源對(duì)異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成的影響（Mean±SD，n=3）Table4 Effect of various nitrogen sources on pH,OD600 and EPS produced by SJR-16-1

綜合試驗(yàn)結(jié)果和成本考慮，在半合成培養(yǎng)基MRS的基礎(chǔ)上確定的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。

2.4 菌株胞外多糖最佳合成條件的研究

為確定異腸球菌SJR-16-1最適生長條件，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)，分別選取pH為A因素，發(fā)酵溫度為B因素，發(fā)酵時(shí)間為C因素，各取4個(gè)水平，以胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行L16（44）正交試驗(yàn)[8]，因素水平見表5，試驗(yàn)結(jié)果如表6、7所示。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Project of the orthogonal experiment

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of The orthogonal experiment

由正交試驗(yàn)和方差結(jié)果可知：最優(yōu)組合為A2B1C1，即溫度30℃，pH6.0，發(fā)酵時(shí)間14 h，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)結(jié)果影響顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明較低的培養(yǎng)溫度適合胞外多糖生物合成量的提高。這可能是因?yàn)樵谳^低的溫度下，細(xì)胞生長慢，細(xì)胞壁的合成也慢，從而使較多的磷酸類異戊二烯用于胞外多糖的合成，14 h時(shí)合成量達(dá)到最大，隨著時(shí)間的延長，培養(yǎng)液中乳酸菌的大量生長繁殖，碳源不能滿足微生物生長的需求就會(huì)分解部分合成的胞外多糖，導(dǎo)致檢測(cè)到的胞外多糖含量降低。由于溫度對(duì)結(jié)果影響最小，且溫度低乳酸菌繁殖速度慢，菌體少影響胞外多糖的總產(chǎn)量，因此綜合各個(gè)方面的條件考慮應(yīng)選擇的發(fā)酵條件為：溫度35℃，pH6.0，發(fā)酵時(shí)間14 h。

表7 正交試驗(yàn)的方差分析Table 7 The variance analysis of orthogonal experiment

2.5 優(yōu)化條件與對(duì)照條件的比較結(jié)果

在初始pH6.0的優(yōu)化液體培養(yǎng)基中接種2%的異腸球菌SJR-16-1，置于35℃溫度下發(fā)酵14 h，對(duì)照組為初始pH6.5液體培養(yǎng)基MRS中接種2%的異場(chǎng)球菌SJR-16-1，置于35℃溫度下發(fā)酵14 h測(cè)定其活菌數(shù)和EPS的產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 優(yōu)化組與對(duì)照組的活菌數(shù)和EPS的產(chǎn)量比較結(jié)果Fig.2 The comparative result of cfu/L and EPS production

從圖2結(jié)果可以看出優(yōu)化培養(yǎng)基菌體數(shù)量沒有明顯高于對(duì)照組，而且EPS產(chǎn)量大約是對(duì)照組的3倍～4倍，顯著提高了EPS的合成量。

3 結(jié)論與討論

本項(xiàng)目從內(nèi)蒙古的馬奶酒中分離的乳酸菌種篩選出一株高產(chǎn)胞外多糖的菌株，經(jīng)鑒定為異腸球菌。經(jīng)試驗(yàn)在半合成培養(yǎng)基MRS的基礎(chǔ)上優(yōu)化的培養(yǎng)基為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O 0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。

接種2%的異腸球菌SJR-16-1于優(yōu)化培養(yǎng)基中35℃下培養(yǎng)時(shí)，初始pH為6.0時(shí)發(fā)酵14 h后，EPS最大合成量為181.29 mg/L，因此初始pH6.0時(shí)35℃是該乳酸菌較為理想的發(fā)酵溫度，14 h是該乳酸菌較為理想的發(fā)酵時(shí)間，并且優(yōu)化后的條件有利于EPS的合成和積累。

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和最適的培養(yǎng)條件與對(duì)照組相比，EPS的產(chǎn)量有很大的提高，有助于整個(gè)研究向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展。為了盡量減少M(fèi)RS液體培養(yǎng)基中存在的大分子物質(zhì)對(duì)多糖測(cè)定的影響，試驗(yàn)中除去了MRS培養(yǎng)基配方中的牛肉膏，優(yōu)化后培養(yǎng)基對(duì)菌株的生長沒有顯著的影響卻可以提高EPS產(chǎn)量，并且還將有利于下一步分離純化EPS。

[1]芒來.蒙古人與馬[M].呼和浩特:內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社,2002:11-13

[2]張篤,劉寧,孟祥晨.乳酸菌胞外多糖的生物學(xué)活性[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2004,31(4):227

[3]王玲燕,李元.微生物胞外多糖生物合成研究進(jìn)展[J].藥物生物技,2002,9(6):369-373

[4]劉立波,劉寧,孟祥晨.影響乳酸菌胞外多糖合成的因素[J].中國乳品工業(yè),2004,32(2):32-34

[5]陳曉紅.乳酸菌胞外多糖的生物合成及其組成和體外抑瘤活性研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2003:10-13

[6]布坎南R E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:22-28

[7]凌代文,東秀珠.乳酸菌細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1996:117-128

[8]白麗娟,殷文政.米酒乳桿菌BXR-5-3胞外多糖合成條件的研究[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(1):49-53

[9]Kimmel S A,Roberts R F,Ziegler G R.Optimization of exopolysaccharide production by L.delbrueckiisubsp.bulgaricus RR grown in a semidefined medium[J].Applied and environmental microbiology,1998,64(4):659-664

Study on the Conditions of Exopolysaccharide Biosynthesis of Enterococcus SJR-16-1

BAI Li-juan1,LI Xiang-dong2
（1.Food Science and Engineering of Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,Liaoning,China；2.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Technology Center,Bright Dairy&Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China）

41strains of lactic acid bacterium comed from Kumiss of the pastoral area in Xilin Guole had been examined for its exopolysaccharide production capacities.It was proved that Enterococcus SJR-16-1 was more procreative.The effects of carbon source,nitrogen source,temperature,culture time and optimum initial pH value of medium on exopolysaccharide produced were studied and a new culture medium for the biosynthesis of exopolysaccharide was formulated.The medium had following composition:peptone,2.0%;glucose,1.5%;maltose1.5%;K2HPO40.2%;MnSO4·4H2O,0.02%;MgSO4·7H2O0.02%;Sodium acetace0.5%;yeast0.5%;Tween80,1 mL/L.The best culture conditions for Enterococcus SJR-16-1 to biosynthesis EPS was the constant pH 6.0 of medium with fermentation at 35℃for 14 h.

Enterococcus;exopolysaccharide;biosynthesis

白麗娟（1979—），女（蒙古），講師，碩士，研究方向：食品微生物的研究與利用。

2011-08-01