原花青素對細(xì)胞損傷抑制的研究

葛昱彤，容嬋，崔倩，徐瑩瑩，卜繁皓，封娟娟，何炎明

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

原花青素對細(xì)胞損傷抑制的研究

葛昱彤，容嬋，崔倩，徐瑩瑩，卜繁皓，封娟娟，何炎明*

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

為了探究原花青素對細(xì)胞膜氧化受損的抑制作用以及濃度和抑制程度之間的關(guān)系。將兔血制成1%紅細(xì)胞（RBC）懸液,制造H2O2氧化模型，再加入不同濃度的原花青素溶液，最后測定紅細(xì)胞溶血量、膜的通透性、丙二醛（MDA）含量。隨著原花青素濃度的增高，溶血百分比相應(yīng)的增大。濃度為0.2 mg/L～0.4 mg/L的原花青素對脂質(zhì)氧化抑制效果最明顯。原花青素可以抑制細(xì)胞氧化損害，而且在一定范圍內(nèi)和原花青素的濃度呈正相關(guān)。

原花青素；細(xì)胞膜；氧化受損；MDA濃度；溶血量

大量的研究表明，無論在體內(nèi)還是體外，過多的氧自由基可引發(fā)紅細(xì)胞（RBC）膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致RBC膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和Hb的氧化損傷，繼而引發(fā)RBC氧化溶血，是發(fā)生溶血性疾病的重要原因之一[1]。原花青素是一種已經(jīng)引起廣泛關(guān)注的保健食品，已經(jīng)證實(shí)它能夠消除酒精代謝過程中損害肝臟的氧化自由基而起到保護(hù)肝臟的作用。為了證實(shí)原花青素對細(xì)胞膜氧化損傷的抑制作用，探究原花青素濃度和抑制作用之間的關(guān)系，本文以H2O2為損傷因素，通過測定溶血程度和丙二醛含量等指標(biāo)，進(jìn)一步觀察不同濃度的原花青素對H2O2誘導(dǎo)的兔RBC過氧化損傷的抑制作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮兔子血紅細(xì)胞；原花青素：深圳市漢榮實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；MDA試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞的分離

取新鮮抗凝靜脈血，2000 r/min離心10 min，棄上清液，再用磷酸緩沖溶液（PBS，pH7.4）重復(fù)洗滌3次，嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)速為2000 r/min離心10 min。最后加入PBS液，配制成1%的紅細(xì)胞懸液。

1.2.2 對照組及實(shí)驗(yàn)組的建立

對照組（CK）：取3 mL 1%紅細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液在37℃溫浴5 min，再加入75 μl（血細(xì)胞懸液和H2O2，體積比為40:1）濃度為30%的H2O2進(jìn)行氧化處理30 min。

實(shí)驗(yàn)組：設(shè)7個(gè)平行試驗(yàn)組，每組取3毫升1%紅細(xì)胞懸液，先往血紅細(xì)胞懸浮液中加入預(yù)先配好濃度為 0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/L 的原花青素溶液300 μl（血細(xì)胞懸液和原花青素體積比為10:1），37℃溫浴30min后，再加入75μlH2O2進(jìn)行氧化處理30min。

1.2.3 溶血百分比的測定

每個(gè)平行組取反應(yīng)混合液2 mL，分兩個(gè)試管，每個(gè)試管1 mL，分別加入2 mL的0.85%生理鹽水和蒸餾水，2000 r/min離心10 min，離心后在540 nm處測其吸光值A(chǔ)、B，按公式（A/B）×100計(jì)算百分溶血度。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量的測定

取1 mL反應(yīng)混合液，按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定方法測其MDA含量。

1.2.5 根據(jù)高鐵血紅蛋白的含量測定細(xì)胞膜通透性

從每個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組中分別取出0.4 mL的溶液，放入離心管中，加入0.1 mL 0.03 mol/L的NaNO2，常溫下2000 r/min離心10 min，用0.85%的生理鹽水洗滌，常溫離心2000 r/min，5 min，吸取上清液，在沉淀中加入3 mL TxitonX-100輕搖，分別用588.7 nm和628 nm的紫外光測定吸光度，根據(jù)公式 MetHb/%=（A628-0.02A588.7）/0.96A588.7×100 測定膜的通透性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

求平均值和方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC溶血度的影響

原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC溶血度的影響結(jié)果見圖1。

圖1 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC溶血度的影響Fig.1 Proanthocyanidins on H2O2-induced hemolysis of RBC

從圖1中可以看出，原花青素對于細(xì)胞氧化受損后的溶血情況確實(shí)有抑制作用，并且隨著原花青素濃度的增大，溶血百分比也相應(yīng)的增大。原花青素抑制溶血有最適的濃度范圍，在此范圍內(nèi)，細(xì)胞溶血量最小。當(dāng)原花青素濃度過大時(shí)，可能由于滲透壓的原因，也會使紅細(xì)胞溶血度略有增加。

2.2 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC MDA含量的影響

丙二醛（MDA）含量的測定，是最直接的測定膜中脂質(zhì)氧化程度的重要參數(shù)。原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC MDA含量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC MDA含量的影響Fig.2 proanthocyanidins on H2O2-induced RBC MDA content

從圖2中我們可以看出，原花青素對脂質(zhì)氧化也有明顯的抑制作用。在濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L之間，MDA含量最低，表明抑制程度最明顯，這與溶血量得出的結(jié)果相一致。但是在原花青素為0.05 mg/L時(shí)，出現(xiàn)了高峰，我們認(rèn)為可能與操作時(shí)的誤差有一定關(guān)系。

2.3 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC高鐵血紅蛋白含量的影響

細(xì)胞膜對NaNO2是不能透過的，但是受損的細(xì)胞膜通透性會發(fā)生變化，而NaNO2進(jìn)入細(xì)胞后會使細(xì)胞內(nèi)的亞鐵血紅蛋白生成高鐵血紅蛋白，因此測量細(xì)胞內(nèi)高鐵血紅蛋白的含量就會反映出細(xì)胞膜的受損情況。原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC高鐵血紅蛋白含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 原花青素對H2O2誘導(dǎo)的RBC高鐵血紅蛋白含量的影響Fig.3 proanthocyanidins on H2O2-induced RBC levels of methemoglobin

從圖3中可以看出，對照組的細(xì)胞膜通透性很大，而加入原花青素的實(shí)驗(yàn)組膜通透性降低并且當(dāng)原花青素的濃度是0.4 mg/L時(shí)，膜通透性最小，推測此濃度的原花青素對細(xì)胞膜的保護(hù)程度最大。

3 討論與結(jié)論

紅細(xì)胞（RBC）是血液的主要有形成分，在血液中擔(dān)負(fù)著對組織進(jìn)行氣體交換的作用。此外，RBC膜富含不飽和脂肪酸，這種不飽和脂肪酸對活性氧誘導(dǎo)的過氧化非常敏感，因此是最容易受到過氧化損傷的細(xì)胞。H2O2是活性氧的一種，在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞線粒體、微粒體、漿膜和胞漿中均可產(chǎn)生。本研究選擇H2O2作為損傷因素，而抗氧化劑可以清除活性氧，抑制脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡。

自由基誘導(dǎo)的生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是組織損傷的基礎(chǔ)，許多疾病和外源性損傷的病理過程都與自由基反應(yīng)有關(guān)[3]。在病理狀態(tài)或衰老的情況下，人體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除過少都對機(jī)體造成氧化損傷。

從溶血量、MDA含量、膜通透性測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，原花青素對血細(xì)胞的確可以抑制其受到H2O2的氧化損害。并且這種抑制作用在一定范圍內(nèi)和原花青素的濃度呈正相關(guān)，濃度越大，保護(hù)作用越大。但是當(dāng)超過一定范圍時(shí)，由于滲透壓的原因，將會出現(xiàn)破壞細(xì)胞的現(xiàn)象。

原花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,屬黃酮類化合物，它作為羥基供體,是活性氧的有效清除劑，它能和蛋白質(zhì)結(jié)合防止自由基傷害尤其是脂質(zhì)過氧化,使細(xì)胞維持一定的結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞起著良好的保護(hù)作用，而且其優(yōu)越的抗氧化活性也越來越為人們所青睞。我們相信，隨著科技的進(jìn)步，植物原花色素的開發(fā)與研究前景廣闊，在食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工品等領(lǐng)域可望獲得更高的利用價(jià)值。

[1]劉慧明，丁航，侯敢.檞皮素對過氧化氫誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞過氧化損傷的抑制作用[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，21(4)：317-318

[2]侯志孝.自由基相關(guān)疾病及抗氧化中藥研究[J].天津藥學(xué)，1996,8(1)：18－21

[3]馬蘭萍，劉在群，周波，等.綠茶多酚對自由基誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制作用[J].科學(xué)通報(bào),2000,45(12):1271-1275

The Effect of Procyanidins in Inhibition of Cell Damage

GE Yu-tong,RONG Chan,CUI Qian,XU Ying-ying,BU Fan-hao,FENG Juan-juan,HE Yan-ming*
（School of Life Science,Sun Yat-Sun University,Guangzhou 510275,Guangdong,China）

The destination upon the research was to explore the inhibition of procyanidins on cell membrane oxidative damage,as well as the relationship between procyanidins concentration and the inhibition.We manipulated 1%rabbit blood erythrocytes (RBC)suspension and manufacture H2O2oxidation model.The experimental group was treated with different concentration of procyanidins solutions before joining the H2O2.hemolysis,cell membrane permeability,and malondialdehyde(MDA)level of which was determined.Compared with CK group,procyanidins treatment resulted in a dose-dependent decrease of hemolytic degree and MDA content.When the concentration of procyanidins was between 0.2mg/L and 0.4 mg/L,antioxidant was most obvious effect.Procyanidin had the capability of inhibiting hydroperoxide-induced hemolysis and peroxidetion of RBC,which was positively associated with concentration of procyanidins with limitation.

procyanidins;cell membrane;oxidation membrane;MDA concentration;hemolytic volume

國家人才基金項(xiàng)目（J0730638）；中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金（KF200928）

葛昱彤（1988—），女（漢），本科，研究方向：生物化學(xué)。

*通信作者：何炎明（1954—），男（漢），高級工程師，主要研究方向：細(xì)胞生物學(xué)，植物生理。

2011-11-01