液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定茶葉中多菌靈殘留

田艷鈴，王浩

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京 100094）

多菌靈又名棉萎靈，是一種高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，對多種作物由真菌（如半知菌、多子囊菌）引起的病害有防治效果。其作用機理是通過干擾菌體細胞紡錘體的形成，干擾細胞分裂，對植物具有良好的保護和治療作用。在茶樹上,主要用于防治茶芽枯病、茶白星病、茶輪斑病、茶褐色葉斑病等葉部病害和茶枝梢黑點病等。多菌靈的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,殘效期長，人們長期飲用含有多菌靈殘留的茶水可能引起慢性中毒。目前，我國對茶葉設(shè)定的限量為5.0mg/kg，日本的肯定列表制度對茶葉設(shè)定的限量為0.1 mg/kg，而我國茶葉中多菌靈殘留國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法檢出限為0.2mg/kg，這無疑增加了我國茶葉對日出口的風(fēng)險。

目前，茶葉中多菌靈殘留的分析方法主要有熒光分析法、紅外光譜法、氣相色譜法、薄層掃描法、高效液相色譜法等。其中，薄層掃描法靈敏度較低；熒光法操作較繁瑣且易受干擾；氣相色譜法需要對樣品進行衍生化處理,易造成多菌靈損失；高效液相色譜法前處理或者毒性較大（如用苯做提取液）[1]，或者儀器要求較高（如需要用凝膠滲透色譜儀或溶劑快速提取儀等前處理儀器）[2-3]，直接影響方法的適用范圍。

本文確定了用0.2 moL/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）超聲提取樣品，OASIS MCX固相萃取柱凈化富集，采用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法進行定性定量分析，取得滿意效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1.1.1 儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，配Agilent1200型液相色譜儀（Agilent公司，美國；KQ-5200型超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：Milli-Q公司，美國；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海市亞榮生化儀器廠；NEVADTM 111型氮氣吹干儀：Organomation Association公司，美國；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.1.2 試劑和材料

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（色譜純）；鹽酸（分析純）；氨水（分析純）；多菌靈購自國家標(biāo)物中心，純度為98%～99%；OASIS MCX固相萃取柱（美國waters公司，3cc，60 mg）；實驗所選用材料為本單位所檢驗樣品。

1.2 分析條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱：3.0 mm×50 mm，1.8 μm；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相0.1%甲酸的水溶液+乙腈，洗脫梯度見表1。

表1 分離多菌靈的較佳洗脫梯度Table 1 Optimal elution condition for separation of Carbendazim

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測；干燥氣：N2；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣溫度：340 ℃；干燥氣流速：8 L/min。多菌靈質(zhì)譜分析的條件參數(shù)見表2。

表2 多菌靈的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Parameter of Mass spectra of Carbendazim

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1.25 g樣品，精確至0.01 g，置于25 mL具塞比色管中，用0.2 moL/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）定容至刻度，超聲提取40 min，8000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確移取上清液10 mL至50mL燒杯中，將溶液以1 mL/min左右的流速通過固相萃取柱，待溶液完全流出后，先用3 mL 0.2 mol/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）沖洗燒杯合并過柱，然后再用3 mL甲醇淋洗萃取柱，最后用4 mL含4%氨水的甲醇溶液洗脫萃取柱，氮氣吹干，再加入1 mL 50%甲醇水溶液，混合搖勻，進樣10 μL進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的的優(yōu)化

茶葉中成分復(fù)雜，色素含量較高，而多菌靈屬于堿化合物，在酸性條件下易于溶解，因此本方法通過0.2 mol/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）提取樣品中的多菌靈。超聲波促使樣品中的多菌靈更充分地溶于提取溶液中，簡化了處理過程。通過對比實驗證明，超聲提取40 min能使樣品中多菌靈充分溶出（加標(biāo)回收率>85.0%），因此，選擇此溶液作為樣品提取液。

2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱是利用固體吸附劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使目標(biāo)化合物與基體干擾物分離，再用洗脫液淋洗達到凈化和富集的目的。因為多菌靈是堿性化合物，所以本方法選擇陽離子交換-反相萃取柱。實驗發(fā)現(xiàn)：OasisMCX（美國 waters公司，3cc，60mg）萃取柱能提供對多菌靈的較強保留能力，分別通過0.2 mol/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）和甲醇淋洗萃取柱，能有效地消除樣品中天然色素及非堿性化合物的干擾，凈化效果比較理想。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用100 ng/mL的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，確定多菌靈的分子離子為m/z192.1。按照歐盟委員會指令2002/657/EC對定性分析的要求，選取1個母離子及其2個子離子或2個母離子及其各1個子離子，并依據(jù)子離子相對豐度比即離子比（定性離子／定量離子）和化合物的保留時間來定性。因此，本方法以m/z192.1為母離子，對母離子進行轟擊以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子，選擇豐度較高、干擾較小的離子對m/z 192.1>160.0，192.1>132.0作定性離子對（如圖1所示），選擇離子豐度最高的離子對m/192.1>160.0作定量離子對；在此基礎(chǔ)上重點優(yōu)化了對靈敏度影響較大的碰撞能量，使選定的子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳，從而得到多菌靈的最佳質(zhì)譜參數(shù)（如表2所示）。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

多菌靈屬于中等極性化合物，因此本方法采用梯度洗脫的方法提高分離效果，測試開始時，流動相中乙腈和0.1%甲酸的水溶液的比例為5∶95，保持二者的比例至3 min，然后在3 min～5 min內(nèi)將二者的比例調(diào)整為95∶5，這一部分主要是洗脫樣品中極性較強的雜質(zhì)，5 min～10 min內(nèi)將保持二者的比例為95∶5，這一部分主要是洗脫樣品中目標(biāo)化合物。通過上述兩步梯度，在10 min內(nèi)，可以較好的分離樣品中多菌靈。圖1為加標(biāo)樣品提取離子流圖，從圖1中可以看出多菌靈得到較好的分離。

圖1 碰撞能量為20 eV時多菌靈的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of Carbendazim at the collision energy of 20 eV

圖2 加標(biāo)樣品的抽取離子流圖Fig.2 Extraction spectrum of Carbendazim of spiled sample

2.5 線性范圍與檢出限

將逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進樣10 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性范圍：0.5μg/L～4000μg/L。回歸方程（y為峰面積，Counts；x為濃度，ng/mL）y=414879.96x+40894.66；線性相關(guān)系數(shù)：0.9990。進空白樣,以基線3倍噪聲值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得結(jié)果計算，測得方法檢出限為1.0μg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱取空白樣品4份，每份1.25 g，共2組，分別定量加入標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平分別為0.2、1.0 mg/kg，按供試品溶液制備方法制備后進行測定,結(jié)果見表3?？梢钥闯觯煌瑵舛燃訕?biāo)回收率85.0%～96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.71%。（n=8），滿足試驗要求。

表3 樣品中加標(biāo)回收率Table 3 Recovery of Carbendazim in spiled sample

3 結(jié)論

本文建立了茶葉中多菌靈殘留的高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定方法。該法用0.2 mol/L鹽酸甲醇溶液（1∶1，體積比）超聲提取樣品，OASIS MCX 固相萃取柱凈化富集，C18反相色譜柱對樣品中多菌靈進行有效分離，電噴霧離子化，串聯(lián)質(zhì)譜檢測。實驗表明：本法檢出1.0μg/kg，加標(biāo)回收率高于85.0%，達到了國內(nèi)先進水平，完全滿足國內(nèi)外對茶葉中多菌靈殘留檢測限量要求。

[1]段云龍.NY 660-2003茶葉中甲萘威、丁硫克百威、多菌靈、殘殺威和抗蚜威的最大殘留限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003:2-3

[2]吳剛,吳儉儉,趙珊紅,等.加速溶劑萃取-固相萃取結(jié)合液相色譜分析茶葉中多菌靈殘留量[J].中國食品學(xué)報,2008,8(4):165-168

[3]楊秀敏,陳永艷,胡彥學(xué),等.固相微萃取-高效液相色譜-熒光檢測法分析蘋果汁中的多菌靈和噻菌靈[J].中國食品學(xué)報,2007,7(5):122-126