HPLC法測(cè)定蒙藥白葡萄中齊墩果酸的含量Δ

趙子龍，薛培鳳，王 麗，王 靜，趙 凱（內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059）

白葡萄為葡萄科植物歐洲葡萄Vitis vinifera L.的干燥成熟果實(shí)[1]，蒙藥名為查干-烏珠莫[2]，主要分布在新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)。它具有清肺、止咳、平喘、滋養(yǎng)的功效，用于治療肺熱咳嗽、痰喘、麻疹、口渴等。白葡萄中含有葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖，酒石酸、草酸、枸櫞酸、蘋果酸、白藜蘆醇、齊墩果酸、原花青素等成分[3，4]，其法定標(biāo)準(zhǔn)載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊(cè)）》，但該標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別項(xiàng)。因此，本試驗(yàn)建立了白葡萄中齊墩果酸的含量測(cè)定方法，為評(píng)價(jià)該蒙藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜（HPLC）儀，含紫外-可見檢測(cè)器、LC-20AT色譜工作站（日本島津公司）；AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KH3200E超聲清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

齊墩果酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-200505）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。13批白葡萄藥材采（收）集自新疆各地，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鞠愛華教授鑒定均為葡萄科植物歐洲葡萄V.vinifera L.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[5]

色譜柱：依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（85∶15）；檢測(cè)波長：220 nm，流速：1 mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸0.3576 mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取切碎的本品（不超過5 mm）適量，置冰箱中冷凍后稱取20 g，與4 g硅藻土混合，用小型高速粉碎機(jī)粉碎，取粉末2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇45 mL，靜置30 min，超聲處理（功率：150 W，頻率：50 kHz）30 min，濾過，洗滌濾渣，合并濾液，蒸干，殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取硅藻土0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)[6]

取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入HPLC儀測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，齊墩果酸峰的保留時(shí)間約為15.2 min，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5；在該色譜條件下，陰性對(duì)照溶液對(duì)樣品測(cè)定無干擾。色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液（濃度：0.3576 mg·mL－1）5、8、10、12、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝199914X－27830（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，齊墩果酸進(jìn)樣量在1.788～7.152 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果，RSD＝1.51%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、3、5、7、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.98%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，樣品平均含量為0.08%，RSD＝1.21%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品適量，共6份，分別精密加入一定量齊墩果酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地白葡萄藥材共13批次，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述方法測(cè)定樣品中齊墩果酸的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

白葡萄含糖量高，不易粉碎，只能切成碎塊，但直接切碎后的碎塊極易重新黏附聚集，導(dǎo)致取樣不均、重復(fù)性差。經(jīng)摸索，樣品切碎成不超過5 mm小塊后，必須置冰箱中冷凍，然后再加入一定比例的輔料，并用小型高速粉碎機(jī)才可粉碎均勻，從而解決了上述問題。

試驗(yàn)先考察輔料種類和用量對(duì)藥材粉碎難易程度和藥材分散均勻程度的影響。經(jīng)過比較，藥材與淀粉、滑石粉、硅藻土分別以10∶7、2∶1、5∶1的比例混合，可使粉碎均勻。由于3種輔料對(duì)含量測(cè)定均無影響，在參考文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上，最終選擇硅藻土作為添加輔料。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為蒙藥白葡萄中齊墩果酸的含量測(cè)定方法。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（蒙藥卷）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：369-370.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)[S].1998：12.

[3]馬 龍，劉 濤，向 陽，等.新疆葡萄中3種生物活性物質(zhì)的含量分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18（1）：28.

[4]王勁松.葡萄與葡萄酒中白藜蘆醇的含量及其影響因素[J].寧夏農(nóng)林科技，2003，6：81.

[5]廖麗紅，曾英彤，梁海勇.RP-HPLC法測(cè)定滋陰舒肝顆粒中齊墩果酸的含量[J].中國藥房，2008，19（24）：1896.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄36.

[7]王春勝，魏魁東，劉茂軍，等.冠脈丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中草藥，2007，38（10）：1518.