HPLC法測(cè)定紫果西番蓮葉中白楊素的含量Δ

趙瑞瑞，鄒江冰，孔秋玲，蔣琳蘭（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州510010）

紫果西番蓮Passiflora edulis Sims是西番蓮科西番蓮屬植物，是我國(guó)栽種面積最廣泛的品種之一，目前在我國(guó)臺(tái)灣、福建、廣東、廣西和云南等地均有栽培[1]。其果實(shí)因具有怡人的香味與豐富的營(yíng)養(yǎng)而深受人們喜愛(ài)。在北美及歐洲，多種西番蓮葉提取物已作藥用，具有抗氧化、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、抗菌消炎、利尿、滋補(bǔ)等作用[2]，在治療酒精、尼古丁、嗎啡以及大麻酚的藥物成癮性上也有很好的療效[3]。西番蓮葉提取物在一些國(guó)家已被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，并被正式列入了美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、巴西藥典、瑞典藥典以及其他一些國(guó)家的藥典[4]。

1 儀器與試藥

515 HPLC系統(tǒng)，含1525二元高壓梯度泵、717自動(dòng)進(jìn)樣器、2487雙吸光度檢測(cè)器、Breeze工作站（美國(guó)Waters公司）；JA1003電子分析天平（上海精科天平儀器廠）；TP-320A電子天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；UV-POWER紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

柱色譜硅膠、硅膠G板（青島海洋化工廠）；白楊素標(biāo)準(zhǔn)品（上海同田生物科技有限公司，純度＞98%）；流動(dòng)相所用乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。紫果西番蓮葉購(gòu)于廣東梅州市五華縣百香果園（批號(hào)：20091201），經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院田素英教授鑒定為真品，風(fēng)干粉碎過(guò)80目篩后貯藏于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)白楊素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行最佳吸收波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在220、267、315 nm波長(zhǎng)處有較好吸收，且在220 nm波長(zhǎng)處具有最佳吸收，故本試驗(yàn)選定檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.2 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液 精密稱取白楊素標(biāo)準(zhǔn)品3.000 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為白楊素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.3.2 供試品溶液 稱取紫果西番蓮葉粉末234.0 g，用60%乙醇（料液比1∶30）于60℃加熱回流提取2次，每次2 h，減壓回收溶劑得浸膏，用水分散后依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑采用索式萃取器提取。正丁醇（15.0 g）部分經(jīng)硅膠柱色譜分離、乙酸乙酯-丙酮梯度洗脫，得Fr.2組分4.0 g。再以乙酸乙酯-正丁醇-甲醇（2∶2∶1）為洗脫劑對(duì)Fr.2進(jìn)行硅膠柱純化，得供試品。取標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的甲醇溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-丁酮（9.4∶0.3∶0.3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中檢視，兩者在相應(yīng)位置出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)[9]，故初步確認(rèn)供試品為白楊素。精密稱取供試品5.000 mg，加甲醇溶解并定容至3 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)行HPLC分析。色譜見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取白楊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1、2、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL分別含0.012、0.024、0.048、0.096、0.120 mg白楊素的系列濃度溶液，各進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以白楊素濃度（X，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝986863X+1305.7（r＝0.9980，n＝5）。結(jié)果表明，白楊素的檢測(cè)濃度在0.012～0.120 mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取白楊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.12%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液適量，分別于制備后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.01%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批供試品5.000 mg，共6份，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算白楊素的平均含量。結(jié)果，RSD＝1.78%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知白楊素含量的紫果西番蓮葉提取物適量，共6份，分別精密加入白楊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批次的紫果西番蓮葉樣品適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分離、測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，3批樣品中白楊素含量分別為0.0485%、0.0479%、0.0489%，平均含量為0.0484%，RSD＝1.04%（n＝3）。

3 討論

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

目前，從西番蓮屬植物中分離得到的黃酮類化合物已有20余種，但是從紫果西番蓮葉中分離得到的黃酮類化合物卻很少。由于紫果西番蓮葉中黃酮類化合物含量低等原因，對(duì)其分離、純化比較困難，應(yīng)用HPLC法測(cè)定紫果西番蓮葉中單體化合物的含量就成為一種較可行的方式。本試驗(yàn)首先采用硅膠柱色譜分離法對(duì)紫果西番蓮葉的粗提物進(jìn)行活性成分富集，然后采用薄層色譜法對(duì)其中的白楊素進(jìn)行鑒定，并用HPLC法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可為紫果西番蓮葉中化學(xué)成分的分析測(cè)定提供新的方法和參考，并可廣泛用于西番蓮屬植物中白楊素含量的測(cè)定。

[1]周玉娟，談 鋒，鄧 君.西番蓮屬植物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（15）：1789.

[2]鄒江冰，袁 進(jìn).2種西番蓮葉中黃酮的抗氧化活性研究[J].中國(guó)藥房，2010，21（35）：3280.

[3]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Suppression of alcohol-cessation-oriented hyper-anxiety by the benzoflavone moiety of Passiflora incarnata Linneaus in mice[J].J Ethnopharmacol，2002，81（2）：239.

[4]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Anti-anxiety studies on extracts of Passiflora incarnata Linneaus[J].J Ethnopharmacol，2001，78（2-3）：165.

[5]Salguero B，Ardenghi P，Dias M，et al.Anxiolytic natural and synthetic flavonoid ligands of the central benzodiazepine receptor have no effect on memory tasks in rats[J].Pharmacol Biochem Behav，1997，58（4）：887.

[6]Wolfman C，Viola H，Paladini A，et al.Possible anxiolytic effects of chrysin，a central benzodiazepine receptor ligand isolated from Passiflora caerulea[J].Pharmacol Biochem Behav，1994，47（1）：1.

[7]Brown E，Hurd NS，McCall S，et al.Evaluation of the anxiolytic effects of chrysin：a Passiflora incarnata extract，in the laboratory rat[J].AANA J，2007，75（5）：333.

[8]Sena LM，Zucolotto SM，Reginatto FH，et al.Neuropharmacological activity of the pericarp of Passiflora edulis flavicarpa degener：putative involvement of C-glycosylflavonoids[J].Exp Biol Med（Maywood），2009，234（8）：967.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：336.