川芎嗪聯(lián)合丹參酮ⅡA對缺血再灌注大鼠肺損傷的保護(hù)作用研究

韓敏珍，冉群釵（貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴陽 556000）

體外循環(huán)心臟外科手術(shù)、肺移植、心肺聯(lián)合移植手術(shù)在臨床上已成為常規(guī)手術(shù)，但肺缺血再灌注損傷是術(shù)后最常見的并發(fā)癥和導(dǎo)致死亡（流行病學(xué)調(diào)查顯示其病死率達(dá)35%～40%）的主要原因之一[1～3]。川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）原名芎藭，民間常用其治療跌撲腫痛、頭痛等證。其性味辛、溫、香、燥，乃血中之氣藥，具有辛散、解郁、通達(dá)、止痛等功效。丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）又名赤參、紫丹參、紅根等，民間常用其治療月經(jīng)不調(diào)、熱痹疼痛，心煩不眠、心絞痛等證。其性味苦、微寒，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養(yǎng)血安神等功效[4]。目前對于川芎和丹參聯(lián)合治療肺缺血再灌注損傷方面的研究少有報(bào)道。為此，筆者將川芎有效成分川芎嗪與丹參有效成分丹參酮ⅡA對肺缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用進(jìn)行研究，以期為肺缺血再灌注損傷的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BH-1200型電子天平（上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司）；DZF型真空干燥箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司）；UV3200型紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；MX51型顯微鏡（日本Olympus公司）；AJ5805型微量注射泵（上海安潔電子設(shè)備有限公司）；1-14K型高速離心機(jī)（德國Sigma公司）。

1.2 試藥

鹽酸川芎嗪（珠海遠(yuǎn)程醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20110317，含量：＞99%）；丹參酮ⅡA（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：20110109，含量：90%）；醋酸地塞米松（DEX，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20101105）；維庫溴銨（上海工碩生物技術(shù)有限公司）；丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠70只，♀♂兼用，體重（220±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物使用合格證號(hào)：SCXK（渝）2002001）。

2 方法

2.1 模型的制備

參考Eppinger方法[5]，以維庫溴銨0.6 mg·kg－1·h－1經(jīng)微量注射泵持續(xù)輸注維持麻醉。大鼠右側(cè)臥位，經(jīng)左側(cè)第五肋間進(jìn)胸，離斷左下肺韌帶，游離左肺門，靜脈注射50 u肝素5 min后，用無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門（包括左主支氣管與左肺動(dòng)、靜脈），少量冰鹽水沖洗肺表面，縫線閉合胸腔。阻斷45 min后松開血管夾，形成再灌注。假手術(shù)組的大鼠僅做游離左肺門，并不進(jìn)行夾閉。

2.2 分組與給藥

70只大鼠均分為7組，即空白對照（等容生理鹽水）、假手術(shù)（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、DEX（5 mg·kg－1）和川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中、低劑量（40+12、20+6、10+3 mg·kg－1）組。ig相應(yīng)藥物，每天1次，于缺血前3 d進(jìn)行，連續(xù)3 d。

2.3 指標(biāo)的檢測

2.3.1 MDA含量、MPO活性的檢測 于再灌注24 h后，動(dòng)脈放血處死大鼠，取大鼠血漿按試劑盒說明書檢測MDA含量；留取部分左肺下葉組織凍存，按試劑盒說明書檢測肺組織MPO含量。

2.3.2 濕重/干重比值（W/D）的檢測 取肺吸干表面水分后稱重，為濕重（W）；再置于80℃真空干燥箱干燥48 h至恒重后稱重，為干重（D）。計(jì)算W/D。

2.3.3 肺通透指數(shù)的檢測 于再灌注24 h后，局麻狀態(tài)下將纖維支氣管鏡插入左肺舌段的支氣管，將其端口插入支氣管分支開口，注入37℃的無菌生理鹽水，每次30～50 mL，總量200 mL，以－15 kpa負(fù)壓吸出，收集于容器。取大鼠全血，于4 ℃、3000 r·min－1離心10 min，取上清液。采用考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）測定血清總蛋白含量和支氣管灌洗液（BALF）蛋白含量，按下列公式計(jì)算肺通透指數(shù)：肺通透指數(shù)（%）＝BALF蛋白含量/血清蛋白含量×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MDA含量、MPO活性的測定結(jié)果

缺血再灌注24 h后，與空白對照組比較，模型組MDA含量顯著增加（P＜0.01），MPO活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組MDA含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），MPO活性顯著減弱（P＜0.01或P＜0.05）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組MDA含量有所減少，MPO活性有所減弱，但無顯著性差異（P＞0.05）。MDA含量、MPO活性的測定結(jié)果見表1。

3.2 W/D、肺通透指數(shù)的測定結(jié)果

缺血再灌注24 h后，與空白對照組比較，模型組W/D、肺通透指數(shù)顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組W/D、肺通透指數(shù)顯著減少（P＜0.01或P＜0.05）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組W/D、肺通透指數(shù)有所減少，但無顯著性差異（P＞0.05）。W/D、肺通透指數(shù)的測定結(jié)果見表2。

表1 MDA含量、MPO活性的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of MDA content and MPO activity（±s，n＝10）

表1 MDA含量、MPO活性的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of MDA content and MPO activity（±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組假手術(shù)組模型組DEX組川芎嗪+丹參酮ⅡA高劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA中劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組劑量/mg·kg－1---540±1220±610±3 MDA/mmol·mg－16.89±0.376.72±0.269.31±0.30＊7.06±0.29##7.34±0.31##7.92±0.24#8.87±0.35 MPO/IU·g－11.13±0.091.19±0.071.64±0.12＊1.20±0.08##1.29±0.12##1.38±0.14#1.46±0.11

表2 W/D、肺通透指數(shù)的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of W/D and lung permeability index（±s，n＝10）

表2 W/D、肺通透指數(shù)的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of W/D and lung permeability index（±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組假手術(shù)組模型組DEX組川芎嗪+丹參酮ⅡA高劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA中劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組- - - 540±1220±610±34.15±0.164.17±0.145.73±0.09＊4.24±0.11##4.45±0.08##4.87±0.13#5.19±0.110.69±0.110.74±0.092.84±0.09＊0.85±0.12##1.24±0.17##1.89±0.14#2.42±0.08劑量/mg·kg－1W/D肺通透指數(shù)

4 討論

肺缺血再灌注后機(jī)體供氧突然增加，產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物，中性粒細(xì)胞（PMN）大量生成，激活與釋放多種炎性介質(zhì)，引起微血管損傷[6]。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中形成的代謝產(chǎn)物，其含量高低不僅反映了體內(nèi)氧化程度，并且被視為判斷氧自由基產(chǎn)生和組織損傷的主要標(biāo)志之一[7]。PMN中存在MPO，每個(gè)細(xì)胞所含該酶的量約為細(xì)胞干重的5%，通過分析該酶活性可間接測定PMN的數(shù)量，反映PMN的異常情況，也間接反映組織損傷水平。有報(bào)道[8]，肺經(jīng)缺血再灌注后，PMN的激活與黏附可引起微血管通透性增高，細(xì)胞間質(zhì)水腫，肺含水量增多，是患者呼吸功能下降的原因之一。W/D表示組織水腫形成情況，間接反映毛細(xì)血管的通透性。肺通透指數(shù)能更加直觀地反映肺的通透性。

本研究表明，模型組較空白對照組大鼠血漿MDA含量顯著增加（P＜0.01），肺勻漿MPO活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01），W/D、肺通透指數(shù)顯著增加（P＜0.01），表明肺缺血再灌注模型大鼠復(fù)制成功。川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組較模型組大鼠血漿MDA含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），肺勻漿MPO活性顯著減弱（P＜0.05或P＜0.01），W/D、肺通透指數(shù)顯著減小（P＜0.05或P＜0.01）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)有改善趨勢但無顯著性差異，表明川芎嗪+丹參酮ⅡA聯(lián)合用藥對肺缺血再灌注損傷大鼠有保護(hù)作用。

綜上所述，川芎嗪+丹參酮ⅡA聯(lián)合用藥可減少過氧化物MDA的生成，減弱MPO活力，從而起到減少PMN數(shù)量的作用，并能降低W/D和肺通透指數(shù)以增加肺與毛細(xì)血管的通透性，從而在臨床對肺缺血再灌注損傷的用藥方面提供實(shí)驗(yàn)支持。

[1]Apostolakis E，F(xiàn)ilos KS，Koletsis E，et al.lung dysfuction following cardiopulmonary bypass[J].J Card Surg，2010，25（1）：47.

[2]胡克儉，葉 磊，姜 楨，等.體外循環(huán)中急性肺水腫分析[J].上海生物醫(yī)學(xué)工程，2002，23（1）：7.

[3]Ng CSH，Wan S，Yim APC，et al.Pumonary dysfunction after cardiac surgery[J].Chest，2002，121（2）：1269.

[4]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：38、70.

[5]Bellido-Reyes YA，Akamatsu H，Kojima K，et al.Cytosolic phospholipase A2inhibition attenuates ischemia-reperfusion injury in an isolated rat lung mode[J].Transplantation，2006，81（12）：1700.

[6]Van der Kaaij NP，Kluin J，Haitsma JJ，et al.Ischemia of the lung causes extensive long-term pulmonary injury：an experimen-tal study[J].Respir Res，2008，9（1）：28.

[7]David I，Sternberg MD，Ram Gowda BS，et al.Blockade of receptor for advanced glycation end product attenuates pulmonary reperfusion injury in mice[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2008，136（6）：1576.

[8]de Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al.Ischemia-reperfusion-induced lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med，2003，167（4）：490.