褐藻多糖硫酸酯精提物對慢性腎衰模型大鼠的保護作用研究Δ

李娟，何海霞，周遠大#，郝守祝（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶40006；.北京世紀博康醫(yī)藥科技有限公司，北京 00070）

慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）是各種原因?qū)е履I臟慢性進行性損害，使其不能維持基本功能，臨床以代謝產(chǎn)物和毒素的潴留，水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及某些內(nèi)分泌功能異常等表現(xiàn)為特征的一組綜合征。目前，晚期慢性CRF患者只能依賴腎臟替代療法（透析、腎移植）來延長生命。在CRF治療過程中，尤其是對早、中期CRF，中醫(yī)藥（特別是利用海帶、昆布等海洋藥物）有著自身的特殊優(yōu)勢和豐富的臨床經(jīng)驗。據(jù)文獻報道[1～3]，褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan sulfate，F(xiàn)S）具有改善腎功能、延緩病情進展的功效。但目前臨床上應(yīng)用的FS僅是粗提物，由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等單糖和硫酸基組成，總有效成分含量僅50%左右；其精提物（Refined fucoidan sulfate extraction，RFSE）為高純度的單一組分，由巖藻糖、半乳糖和硫酸基組成，總有效成分含量可達90%以上[4]。本研究通過復(fù)制腺嘌呤所致大鼠CRF模型，探究RFSE對CRF的療效，為臨床用藥提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALCYON300型全自動生化測定儀（美國雅培公司）；MEK-6108K型血液分析儀（日本光電公司）。

1.2 試藥

腺嘌呤（新鄉(xiāng)拓新化工廠，批號：060504）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：20050545）；RFSE、FS（北京世紀博康醫(yī)藥有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、總蛋白、白蛋白、考馬斯亮藍試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 動物

清潔級SD大鼠88只，♂，體重180～240 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）20070001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學(xué)方法

2.2 模型的復(fù)制與分組、給藥

取SD大鼠88只，隨機抽取10只作為正常對照，其余大鼠ig 365 mg·kg－1腺嘌呤復(fù)制CRF模型，每天1次，連續(xù)20 d。于復(fù)制模型結(jié)束后，根據(jù)血清Scr和BUN的含量，選取復(fù)制模型成功的大鼠60只，參考文獻[5]隨機分成6組，即模型（1%羧甲基纖維素鈉）、地塞米松（0.1 mg·kg－1）、FS（100 mg·kg－1）和RFSE高、中、低劑量（100、50、25 mg·kg－1）組。ig給藥，給藥容量為1 mL·100 g－1，每天2次，連續(xù)25 d。

2.3 RFSE對模型大鼠一般狀況、24 h尿量和尿蛋白的影響

觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、體重、體毛、大小便、攝食和飲水狀況。于末次給藥后，將大鼠分別置于代謝籠中收集24 h尿量，并以考馬斯亮藍法檢測尿蛋白。

結(jié)果，正常對照組大鼠體毛呈白色、有光澤、順滑，無脫毛現(xiàn)象，飲食正常，反應(yīng)靈敏。模型組大鼠毛色日漸變灰、無光澤、不順滑，脫毛現(xiàn)象嚴重，精神萎靡，活動緩慢且減少，飲食、尿量減少，體重進行性下降。各用藥組較模型組上述情況有不同程度的改善，其中以RFSE高劑量組的一般狀況最好。

與正常對照組比較，模型組24 h尿量、24 h尿蛋白均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，RFSE高、中、低劑量組24 h尿量均顯著降低（P＜0.05），高劑量RFSE作用尤為顯著；RFSE高、中、低劑量組24 h尿蛋白均顯著減少（P＜0.01）。與FS組比較，RFSE高劑量組24 h尿蛋白顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較見表1。

表1 各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

表1 各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與FS組比較：△P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01；vs.FS group：△P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組24 h尿量/mL 11.10±6.9725.40±15.51＊15.20±8.46#20.10±12.5611.12±14.10#16.10±14.81#17.97±7.53#24 h尿蛋白/mg 5.6±1.4735.13±6.93＊18.03±6.71##12.97±5.12##7.57±2.82##△15.98±6.50##18.73±5.61##

2.4 RFSE對模型大鼠血常規(guī)和血液生化指標的影響

大鼠末次給藥后禁食24 h，取血5～6 mL，抗凝血測定紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白（Hb），并測血清Ca2+、P3+、BUN和Scr含量。

與正常對照組比較，模型組RBC和Hb的含量顯著減少（P＜0.05）；Scr、BUN和P3+的含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，RFSE高、中、低劑量組RBC和Hb的含量略有增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；Scr、BUN和P3+的含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05）。與FS組比較，RFS高、中、低劑量組RBC、Hb、Scr、BUN、Ca2+、P3+無顯著性差異（P＜0.05）。各組大鼠血液學(xué)指標比較見表2；各組大鼠血液生化指標比較見表3。

表2 各組大鼠血液學(xué)指標比較（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血液學(xué)指標比較（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組RBC/1012·L－16.53±0.334.92±0.55＊6.64±0.54#5.79±0.41#5.10±0.235.23±0.365.15±0.40 Hb/g·L－1126.20±5.53100.50±9.61＊133.40±7.52#116.60±4.95#104.50±4.14107.20±5.77104.40±6.35

表3 各組大鼠血液生化指標比較（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血液生化指標比較（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組Scr/μmol·L－1115.10±6.89231.78±59.25＊127.20±13.62##122.42±14.93##122.43±7.99##125.92±24.03##126.35±16.75##BUN/mmol·L－15.52±1.4123.92±9.34＊12.19±2.99##13.00±2.48##12.02±2.67##13.64±4.48#14.54±5.20#Ca2+/mmol·L－12.35±0.122.24±0.392.45±0.152.31±0.182.12±0.142.13±0.182.14±0.21 P3+/mmol·L－12.49±0.154.48±1.04＊2.62±0.15##2.77±0.30##2.82±0.28##2.93±0.21##2.72±0.22##

2.5 RFSE對模型大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

麻醉處死大鼠，取腎組織行病理形態(tài)學(xué)觀察。參考文獻[6]，并結(jié)合觀察情況，對腎小球、腎小管-間質(zhì)病變進行半定量分級?！埃奔墸耗I小球、腎小管、間質(zhì)正常；“+”級：變性腎小球數(shù)目小于腎小球總數(shù)的1/3，腎小管壞死面積小于皮質(zhì)面積的1/3，間質(zhì)輕度水腫伴纖維組織增生；“++”級：變性腎小球數(shù)目占腎小球總數(shù)的1/3～2/3，腎小管壞死面積占皮質(zhì)面積的1/3～2/3，間質(zhì)中度水腫伴纖維組織增生；“+++”級：變性腎小球數(shù)目超過腎小球總數(shù)的2/3，腎小管壞死面積超過皮質(zhì)面積的2/3，間質(zhì)重度水腫伴纖維組織增生。

與正常對照組比較，模型組大鼠腎臟組織病理改變顯著。與模型組比較，RFSE高、中劑量組腎小管-間質(zhì)分級情況顯著降低（P＜0.01）。與FS組比較，RFSE高、中劑量組病理情況顯著改善（P＜0.01）。大鼠腎臟組織病理改變比較見表4；腎臟病理切片見圖1。

3 討論

研究表明[7]，通過腺嘌呤復(fù)制的CRF模型與人類CRF所表現(xiàn)出來的代謝紊亂十分接近。因此，本研究應(yīng)用此模型來研究RFSE對CRF的保護作用。血清Scr、BUN作為CRF診斷及嚴重程度分級的主要指標，又與患者多種臨床癥狀如惡心、嘔吐、心悸、胸悶、皮膚瘙癢與各種出血的發(fā)生率呈正相關(guān)，故降低血中這些毒素成為緩解腎功能衰竭的重要任務(wù)[8]。蛋白尿是預(yù)示腎病進展與預(yù)后的重要標志之一，其對腎小球上皮細胞與近曲小管細胞等都有損傷作用；且大量蛋白尿超過腎小管重吸收能力，在腎小管內(nèi)形成管形尿，加重上皮細胞損害與間質(zhì)炎癥，故控制尿蛋白對CRF患者有重要意義。CRF在表現(xiàn)上除了腎臟功能有一定的改變，還存在不同程度的貧血，因為促紅細胞生成素90%在腎臟分泌，腎功能減退必然會引起促紅細胞生成素的分泌減少而導(dǎo)致貧血[9]，故檢測RBC和Hb是作為急慢性腎衰鑒別診斷的重要依據(jù)[10]。另外，由于CRF還存在電解質(zhì)紊亂以及不同程度的腎臟病理改變，故也應(yīng)進行相應(yīng)考察。

表4 大鼠腎臟組織病理改變比較Tab 4 Comparison of pathological changes of renal tissue in rats

圖1 腎臟病理切片圖（HE，100×）Fig 1 Pathological photograph of kidney（HE，100×）

RFSE是從海洋中藥海帶中制備獲得的一種由巖藻糖、半乳糖和硫酸基組成的新結(jié)構(gòu)高純度的低分子硫酸多糖類藥物。其研制依據(jù)就是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論以及中醫(yī)文獻古籍關(guān)于海帶、昆布利水瀉濁作用，針對濕濁內(nèi)阻證腎病綜合征腎功能衰竭的病因病機，突出中醫(yī)治療腎病的優(yōu)勢，結(jié)合海洋藥物研究的最新進展和現(xiàn)代提取工藝而確立的。本研究結(jié)果表明，高、中、低劑量RFSE均可顯著改善模型大鼠的精神狀態(tài)、攝食等一般狀況，能顯著降低模型大鼠血清中Scr、BUN和P3+的水平，減少腺嘌呤所致的24 h尿量和尿蛋白的增加；高、中劑量RFSE還可使模型大鼠的腎臟病理改變得到一定程度的改善；各劑量RFSE對RBC和Hb的含量降低也顯示了一定的緩解作用。與同等劑量的FS比較，RFSE對24 h尿量、尿蛋白和腎臟病理改變的影響作用較好。提示RFSE對腺嘌呤所致大鼠腎功能損害有較好保護作用，能較好的延緩腎衰的進展，但至于具體的作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，RFSE在連續(xù)多次給藥的過程中，對腺嘌呤所致大鼠腎功能損害顯示了較好的保護作用；而且前期研究顯示RFSE急性毒性實驗ip的半數(shù)死亡劑量是FS的近5倍，相對于FS具有更高的安全性，能夠滿足CRF患者長期用藥的需要，是一種理想的治療腎衰竭的藥物，值得進一步應(yīng)用于臨床研究。

[1]胡 昭，王兆華，彭 濤，等.褐藻多糖硫酸酯對阿霉素腎硬化大鼠腎臟保護作用的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，44（3）：291.

[2]劉建春，鄭法雷，劉燕萍.褐藻多糖硫酸酯對腺嘌呤致大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及其機制探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008，9（2）：1.

[3]周二燕，盧盛貞，溫玉瑋.海昆腎喜膠囊治療慢性腎功能衰竭30 例臨床觀察[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2007，11（3）：135.

[4]郝守祝，李 靜.低分子量褐藻多糖硫酸酯在制備治療腎臟疾病的藥物中的用途[P].中國專利：200710064313.3，2007-03-12.

[5]徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)[M].第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：407.

[6]王 丹，呂永曼，劉曉城.羥苯磺酸鈣對慢性腎衰模型大鼠血管活性物質(zhì)的影響[J].中國藥房，2005，16（11）：821.

[7]Yokozawa T，Zheng PD，Oura H，et al.Animal model of adenine induced chronic renal failure in rats[J].Nephron，1986，44（3）：230.

[8]Wuthrich B.Epidemiology of allergies in Switzerland[J].Ther Umsch，2001，58（5）：253.

[9]董志剛，馬曉燕，張 明，等.溫腎益精降濁法治療腺嘌呤致大鼠慢性腎功能衰竭的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（3）：45.

[10]朱燕文，陳愛珍.慢性腎衰患者外周血細胞指標檢測的臨床意義[J].中國初級衛(wèi)生保健，2000，14（6）：50.