慢性碘過量對Wistar大鼠甲狀腺功能及垂體促甲狀腺素β表達(dá)的影響

姜雅秋，李寧娜，劉秀，單忠艷，滕衛(wèi)平

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，沈陽110001）

甲狀腺調(diào)節(jié)機(jī)制有兩個(gè)方面，一是下丘腦—垂體—甲狀腺軸系統(tǒng)，二是甲狀腺自身調(diào)節(jié)。碘是合成甲狀腺激素的主要原料，也是影響甲狀腺健康的重要環(huán)境因素。碘缺乏病嚴(yán)重影響人的身體和智力發(fā)育。1990年，世界兒童問題首腦會議倡導(dǎo)在世界范圍內(nèi)普及碘化食鹽。然而關(guān)于補(bǔ)碘上限一直沒有定論，高碘相關(guān)的甲狀腺疾病發(fā)病率顯著增加［1］。我們在流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，正常人群的血清促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）值隨碘攝入量增加而增高，TSH的中位數(shù)和參考范圍均呈現(xiàn)碘依賴性關(guān)系。盤山、彰武、黃驊的正常人群TSH中位數(shù)分別為1.22、1.41和1.99 mU/L，3個(gè)地區(qū)TSH正常值范圍分別為0.33～3.50、0.20～4.62和0.56～6.00 mU/L。本研究使用普通Wistar大鼠，制作碘適量、3 倍碘過量（3 times excess of iodine，3 HI）、6倍碘過量（6 times excess of iodine，6HI）、10 倍碘過量（10 times excess of iodine，10HI）和50倍碘過量（50 times excess of iodine，50 HI）的慢性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停诒O(jiān)控碘攝入量的同時(shí)測定血清和垂體組織TSH含量的變化，并觀察垂體組織形態(tài)和TSH蛋白的表達(dá)的變化，分析碘過量對下丘腦垂體甲狀腺軸的慢性影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

碘營養(yǎng)正常的普通Wistar大鼠60只，由上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量220～250 g，按照性別和體質(zhì)量隨機(jī)分入正常對照組（普通飼料+雙蒸水）、3HI組（普通飼料+NaI 400 μg/L雙蒸水）、6HI組（普通飼料+NaI1000 μg/L雙蒸水）、10HI組（普通飼料+NaI1500 μg/L雙蒸水）和50HI組（普通飼料+NaI 4 800 μg/L雙蒸水），每組12只。各組動物于補(bǔ)碘開始后第8周斷頭處死。

1.2 取材

使用代謝籠收集大鼠24 h尿標(biāo)本，-20℃保存，記錄24h飲水量和尿量。動物稱重后，按照0.4mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉。從劍突向上打開左胸腔，使用10 mL注射器心臟取血，4℃靜置2 h，3000 r/min離心20 min，分離血清，-70℃凍存。斷頭器斷頭3 min內(nèi)取出腦及垂體組織，于-40℃干冰異戊烷液內(nèi)30 s快速冷凍腦及垂體組織，隨后裝入凍存管于-70℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 尿碘的測定：采用砷鈰催化分光光度法（WS/T107-1999），該方法測定碘含量的敏感度為1 ng（5 μg/L），批內(nèi)變異（2.14～6.68）%，批間變異（2.01～2.52）%。

1.3.2 垂體勻漿：將垂體在冷PBS溶液冰浴中手動勻漿5 min，制備成3%的組織勻漿，經(jīng)4℃、3000 r/min離心20 min后取上清待測。

1.3.3 甲狀腺功能測定：取上述凍存血清，按照試劑盒說明測定血清TSH、游離四碘甲狀腺原氨酸（free tetraiodothyronine，F(xiàn)T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）水平。

1.3.4 垂體TSH含量的測定：取凍存垂體組織勻漿液，依試劑盒說明依次加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，使反應(yīng)液充分反應(yīng)，4℃過夜。按照試劑盒說明洗滌，應(yīng)用γ閃爍計(jì)數(shù)儀測定TSH濃度。

1.3.5 垂體TSH免疫組織化學(xué)染色：制作冰凍連續(xù)組織切片，每片厚10 μm，室溫于4%的多聚甲醛—PBS（pH 7.4）中固定60 min。分別用蒸餾水和PBS洗5 min，洗3次。3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗。10%正常羊血清室溫封閉10 min，不洗。滴加1∶400兔抗大鼠TSH一抗4℃過夜，PBS沖洗；二抗聚合物室溫30 min，PBS沖洗。DAB顯色5 min，沖洗；蘇木素復(fù)染核5 min，沖洗，反藍(lán)脫水，封片。復(fù)染后的切片用顯微鏡（Olympus）數(shù)碼相機(jī)攝入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Image Pro-plus軟件進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清TSH、FT3和FT4的變化

3HI組和6HI組雌鼠血清TSH濃度與正常對照組相比無明顯變化（P>0.05）；10HI組和50HI組雌鼠血清TSH的含量較正常對照組升高（P<0.05）。3HI組和6HI組與正常對照組相比血清FT3水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；10HI組與正常對照組及3HI組相比血清FT3濃度顯著升高（P<0.05）；50 HI組與10 HI組比較血清FT3降低（P<0.05），但與其他加碘組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。隨碘攝入量升高 FT4濃度呈升高趨勢，6HI、10 HI、50 HI組與正常對照組、3HI組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FT3/FT4的值呈下降趨勢，50 HI組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他各加碘組與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

不同碘攝入量組雄鼠血清TSH、FT3、FT4濃度及FT3/FT4的值與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 垂體TSH含量和TSHβ表達(dá)的變化

雌鼠垂體組織內(nèi)TSH的含量隨碘攝入量升高呈增高趨勢，3HI組、6HI組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10HI組、50HI組較正常對照組明顯升高（P<0.05）。碘攝入量的增高并沒有引起雄鼠垂體內(nèi)TSH含量的明顯升高。見表2。

隨碘攝入量的升高，雌鼠垂體TSHβ表達(dá)陽性的細(xì)胞逐漸增多，與正常對照組比較10HI組和50 HI組TSHβ表達(dá)量明顯增高（P<0.05），雄鼠垂體TSHβ表達(dá)陽性的細(xì)胞也有升高的趨勢，但不如雌鼠明顯，只有50 HI組較正常對照組TSHβ表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。見圖1，表2。

3 討論

本研究結(jié)果顯示：隨碘攝入量的升高，雌鼠血清FT3先升后降，F(xiàn)T4濃度逐漸升高，F(xiàn)T3/FT4的值下降，雄鼠與正常對照組相比FT3、FT4、FT3/FT4的值無明顯變化。這些結(jié)果與近年來關(guān)于高碘動物甲狀腺功能改變的研究結(jié)果相似，即高碘并未引起血中T4濃度降低，相反血清T4水平有隨碘攝入量增加而上升的趨勢，而T3水平有隨碘攝入量增加而下降的趨勢［2，3］。本課題組前期的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，給Wistar大鼠喂以不同濃度的含碘水3個(gè)月，3倍以上碘過量使Wistar大鼠血清FT4升高，TSH有升高趨勢。

本研究還發(fā)現(xiàn)，碘過量對雌鼠和雄鼠的血清甲狀腺激素的影響不盡相同，雄鼠無明顯變化，我們認(rèn)為這可能是性激素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，閹割大鼠的垂體其TSH接受甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）反饋?zhàn)饔玫拿舾行栽黾?，雌激素的給予可刺激閹割鼠TH的釋放。Klammer等［4］報(bào)道甲氧肉桂酸辛酯具有雌激素樣作用，可刺激甲狀腺內(nèi)TSH受體的表達(dá)，不影響鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，減少了肝內(nèi)Ⅰ型脫碘酶（type1deiodinase，D1）的活性。Bisschop 等［5］的研究指出，雌激素的投與使變性手術(shù)患者的甲狀腺素結(jié)合球蛋白水平升高，而睪酮使之降低；雌激素的投與不影響變性手術(shù)患者T3/T4的值，而睪酮卻使T3/T4的值增加。我們認(rèn)為是碘過量和雌雄激素的共同作用，使雌、雄鼠的反應(yīng)不同。

最近發(fā)現(xiàn)卵巢存在鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，這提供了卵巢攝取碘及其與甲狀腺功能相似的可能機(jī)制，進(jìn)一步的研究確定了卵泡液中TH的存在，卵泡液內(nèi)T4的含量低于血清，而T3含量在血清范圍內(nèi)或略高，卵泡液內(nèi)T4的含量與血清內(nèi)T4的含量呈正相關(guān)，而T3無此相關(guān)性。這提示卵巢的脫碘酶使T4轉(zhuǎn)換成T3，而且同期發(fā)現(xiàn)母馬卵巢脫碘酶的活性在排卵期高于停止排卵的動物。

Lima等［6］報(bào)道雌激素使卵巢切除的成年雌鼠和青春期前雌鼠的甲狀腺質(zhì)量增加，血中T3的含量減少，雌激素的替代治療使之恢復(fù)。高濃度的雌激素替代引起了卵巢切除及青春期前雌鼠對碘的攝取。結(jié)合我們的結(jié)果，我們認(rèn)為雌激素影響了大鼠對碘的攝取，強(qiáng)化了碘過量的作用，同時(shí)我們推測性激素參與影響了脫碘酶的活性。

本研究發(fā)現(xiàn)10HI組和50HI組雌鼠血清TSH水平較正常對照組升高，雌鼠垂體組織內(nèi)TSH的含量以及垂體細(xì)胞TSHβ表達(dá)量也隨碘攝入量的升高而明顯升高。已有研究確定了卵泡液中TH的存在，卵泡液內(nèi)T4的含量低于血清，T3含量在血清范圍內(nèi)或略高，卵泡液內(nèi)T4的含量與血清內(nèi)T4的含量呈正相關(guān)，而T3無此相關(guān)性。這提示卵巢的脫碘酶有能力使T4轉(zhuǎn)換成T3。本研究的結(jié)果也提示，雄鼠的變化與雌鼠不同，碘攝入量的增高并沒有引起雄鼠血清及垂體內(nèi)TSH含量的明顯升高，隨碘攝入量的升高雄鼠只有50 HI組TSHβ表達(dá)量顯示升高。

血清TSH水平的升高是提示甲狀腺功能損傷的早期指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，長期過量碘攝入可引起正常人群血清TSH水平升高。對高碘地區(qū)正常人群的尿碘與TSH值的關(guān)系進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，隨碘攝入量增加血清TSH水平升高。

研究證實(shí)，甲狀腺激素對TSH分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)是通過垂體TSH分泌細(xì)胞中的T3介導(dǎo)的。而垂體TSH分泌細(xì)胞中的T3有50%～80%是由T4在局部產(chǎn)生的，即T4被垂體Ⅱ型脫碘酶（type2deiodinase，D2）脫碘變成T3，剩余部分則直接來自于血液中的T3。過量碘攝入可抑制垂體D2活性，因而導(dǎo)致垂體TSH分泌細(xì)胞中T4向T3轉(zhuǎn)化減少［7～9］。同時(shí)，過量碘攝入還可抑制肝腎組織中的D1活性，使血中的T4向T3轉(zhuǎn)化減少，因而血液中的T3對垂體TSH分泌細(xì)胞中T3的供應(yīng)減少［7～9］。

研究顯示，卵巢切除鼠外源給予雌激素刺激了肝及垂體D1的活性，孕酮抑制了雌激素在肝及垂體這種興奮D1的作用，閹割術(shù)本身增加了大鼠垂體D1的活性而不影響垂體D2的活性。此后有研究發(fā)現(xiàn)，無論甲狀腺功能正常還是切除甲狀腺的雌性大鼠肝內(nèi)D1活性及其mRNA水平均低于雄性。同期的另一研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除引起了垂體和甲狀腺組織D1活性的減少，垂體及肝臟D1活性無明顯變化。

不同碘攝入量雌鼠血清內(nèi)TSH的含量變化與垂體組織內(nèi)TSH的含量變化一致，并且與垂體組織TSH蛋白表達(dá)量相一致，我們認(rèn)為慢性碘過量不但刺激了TSH的釋放，同時(shí)也影響了垂體TSH的合成。本研究組前期的研究結(jié)果提示隨地區(qū)碘攝入量的增加正常人群血清TSH水平增加，且隨人群尿碘濃度的增加血清TSH水平升高，本研究的結(jié)果證實(shí)了對高碘具有耐受性的Wistar大鼠也存在隨碘攝入量的增加血清TSH水平升高，而血清TSH水平的升高是由于慢性碘過量刺激了垂體TSH細(xì)胞的合成和分泌。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雌性和雄性大鼠對碘過量的反應(yīng)不盡相同，我們認(rèn)為可能是與性激素水平的影響相關(guān)。

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