5-Aza-2′-dC通過上調(diào)DR4與DR5表達(dá)增加TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的敏感性

仇鳳啟，趙丹，孫大鵬，劉新莉，李曉曦，馬萍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽110001）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一。西方國家女性乳腺癌發(fā)病率居女性腫瘤的首位，死亡率高達(dá)22.8%［1］。隨著腫瘤分子機(jī)制研究的深入，分子靶點(diǎn)治療成為乳腺癌治療的重要手段。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族成員之一，能通過細(xì)胞外途徑和線粒體依賴的細(xì)胞內(nèi)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5-Aza-2′-dC是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能有效逆轉(zhuǎn)基因甲基化［2］，重建基因的表達(dá)和功能。本研究利用5-Aza-2′-dC預(yù)處理乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞，觀察TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡敏感性的變化，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究如何增強(qiáng)TRAIL抗乳腺癌作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，細(xì)胞用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基，37℃、無CO2條件下培養(yǎng)。鼠抗人FITC熒光標(biāo)記DR4和DR5單克隆抗體購自美國BD公司，鼠抗人caspase-8單克隆抗體購自美國cell-signaling公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體購自康為世紀(jì)公司，RT-PCR引物及RT-PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基公司，MTT購自美國Biosharp公司。5-Aza-2′-dC購自美國Santa Cruz公司。

1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，棄上清更換培養(yǎng)基，隨機(jī)將細(xì)胞分為5-Aza-2′-dC 預(yù)處理組和對(duì)照組。5-Aza-2′-dC（5 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞 96 h，TRAIL（0，50，100，200 ng/mL）處理細(xì)胞12 h。然后，每孔加入5 μg/mL MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 min，室溫靜置20 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處光密度值。

1.3 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同1.2。收集、洗滌處理后細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI說明書進(jìn)行操作。所有樣本避光，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面DR4和DR5蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，5-Aza-2′-dC（終濃度5 μmol/L）處理細(xì)胞96 h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入 Isotype抗體10 μL及 FITC標(biāo)記的 DR4、DR5抗體20 μL，避光孵育20 min。冷PBS洗細(xì)胞1次，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面DR4和DR5蛋白的表達(dá)。

1.5 Western blot檢測(cè)caspase-8蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，5-Aza-2′-dC（終濃度5 μmol/L）處理細(xì)胞96 h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。收集細(xì)胞，用RIPA強(qiáng)裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣，瓊脂糖凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，TBST配制5%脫脂牛奶封閉2 h，用caspase-8一抗+5%脫脂牛奶4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗+5%脫脂牛奶室溫孵育2 h。ECL法發(fā)光顯色。

1.6 Real-time PCR 檢 測(cè) DR4、DR5和 caspase-8 mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，5-Aza-2′-dC（終濃度5 μmol/L）處理細(xì)胞96 h，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。收集細(xì)胞，RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，進(jìn)入反應(yīng)循環(huán)，95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，于60℃收集熒光信號(hào)。結(jié)果用ΔΔCt法分析。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)，序列如 下 ：DR4：Forward：GGAACACAGCATGTCAGTG －CAA，Reverse：TGTCACTCCAGGGCGTACAATC；DR5：Forward：AGCTAAGTCCCTGCACCACGA，Reverse：TGT ACAATCACCGACCTTGACCA；Caspase-8：Forward：CCAAATGCAAACTGGATGATGAC，Reverse：CTCTTG TTGATTTGGGCACAGAC。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，組間分析采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-2′-dC增加TRAIL抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的敏感性

結(jié)果表明：5-Aza-2′-dC預(yù)處理組增殖抑制率為（3.13±0.14）%，（15.77±0.55）%，（56.15±1.31）%和（69.10±1.34）%，對(duì)照組增殖抑制率為（2.73±0.09）%，（11.52±0.91）%，（41.59±1.41）%和（60.48±0.69）%，組內(nèi)及組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）（圖1）。結(jié)果提示：TRAIL對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性，5-Aza-2′-dC能增加TRAIL抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的敏感性。

2.2 5-Aza-2′-dC增加TRAIL誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的敏感性

按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，預(yù)處理組凋亡率分別為（3.58±0.28）%，（20.69±0.24）%，（54.32±0.45）%和（80.30±1.83）%，對(duì)照組凋亡率分別為（3.44±0.27）%，（16.06±0.15）%，（43.44±0.79）%和（73.99±2.54）%，組間及組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖2）。提示 TRAIL誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性，5-Aza-2′-dC能增加TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。

2.3 5-Aza-2′-dC 增加 DR4、DR5和 caspase-8表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：5-Aza-2′-dC預(yù)處理組DR4表達(dá)（83.83%）明顯高于對(duì)照組（4.64%）（圖3A、3B）。預(yù)處理組DR5表達(dá)（88.10%）明顯高于對(duì)照組（10.10%）（圖3 C、3D）。Western blot結(jié)果顯示：5-Aza-2′-dC預(yù)處理細(xì)胞96 h后，MDA-MB-231細(xì)胞caspase-8表達(dá)增加，同時(shí)能誘導(dǎo)caspase-8蛋白的活化（圖3E）。

2.4 5-Aza-2′-dC 增加 DR4、DR5 和 caspase-8mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示：5-Aza-2′-dC預(yù)處理細(xì)胞96 h后，DR4、DR5和caspase-8mRNA表達(dá)增加，表明5-Aza-2′-dC可能在基因水平增加了凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

3 討論

TRAIL作為TNF家族成員之一，能與腫瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而不影響正常組織細(xì)胞，是很有前景的抗腫瘤因子之一。TRAIL受體包括功能性受體DR4/DR5，誘騙受體DcR1/2和OPG［3］。TRAIL與受體結(jié)合誘導(dǎo)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域形成，進(jìn)一步結(jié)合precaspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，通過蛋白剪切作用，形成活化的caspase-8，激活下游通路相關(guān)因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。

雖然TRAIL抗腫瘤作用有特異性優(yōu)勢(shì)，但是很多腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡有抵抗作用，這成為TRAIL發(fā)揮抗腫瘤作用的主要障礙。腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL產(chǎn)生抵抗與受體和凋亡通路相關(guān)因子的表達(dá)水平密切相關(guān)，通過TRAIL與其他藥物聯(lián)合可增加 TRAIL 抗腫瘤敏感性［5］。Horak 等［6］發(fā)現(xiàn)，在子宮癌中由于表觀遺傳學(xué)作用導(dǎo)致DR4表達(dá)缺失，是子宮癌對(duì)TRAIL抵抗的機(jī)制之一。在乳腺癌中存在DR4/DR5基因甲基化，這種基因突變導(dǎo)致的DR4/DR5表達(dá)的降低，也是乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡抵抗的原因［7］。Geelen 等［8］的研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌中caspase-8表達(dá)降低是腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL抵抗的重要原因，通過上調(diào)caspase-8的表達(dá)能重建結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。本研究結(jié)果也表明，通過5-Aza-2′-dC預(yù)處理能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)caspase-8表達(dá)，增強(qiáng)了TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。

多項(xiàng)研究表明，可以通過多種途徑增加TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡敏感性。Kisim等［9］通過AT-101促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞DR4和DR5的表達(dá)，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，Ding等［10］的研究結(jié)果同樣表明，DR4表達(dá)增加及c-FLIP表達(dá)的降低能促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的敏感性。本研究結(jié)果表明，通過5-Aza-2′-dC處理細(xì)胞能明顯增加DR4和DR5的表達(dá)，這種上調(diào)作用發(fā)生在mRNA水平，最終增加了乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用的敏感性。這種上調(diào)可能是由于5-Aza-2′-dC抑制了相關(guān)基因表觀修飾的甲基化作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究通過5-Aza-2′-dC作用乳腺癌細(xì)胞，增加了TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的敏感性，這種作用可能與DR4、DR5和caspase-8的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。但是TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡通路機(jī)制復(fù)雜，尚需進(jìn)一步探討。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012 ［J］.CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

［2］徐寧儒，劉春曉，鄭少波，等.5-雜氮脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)膀胱癌T24細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白激酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（9）：1882-1886.

［3］Pan G，O′Rourke K，Chinnaiyan AM，et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL［J］.Science，1997，276（5309）：111-113.

［4］Kischkel FC,Lawrence DA,Chuntharapai A,et al.Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and5［J］.Immunity，2000，12（6）：611-620.

［5］王宏艷，常瑛.重組可溶性TRAIL聯(lián)合化療藥誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞凋亡［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（3）：364-368.

［6］Horak P,Pils D,Kaider A,et al.Perturbation of the tumor necrosis factor--related apoptosis-inducing ligand cascade in ovarian cancer：overexpression of FLIPL and deregulation of the functional receptors DR4 and DR5［J］.Clin Cancer Res，2005，11（24 Pt1）：8585-8591.

［7］Shin MS,Kim HS,Lee SH,et al.Mutations of tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand receptor1（TRAIL-R1）and receptor2（TRAIL-R2）genes in metastatic breast cancers［J］.Cancer Res，2001，61（13）：4942-4946.

［8］Van Geelen CM,Pennarun B,Ek WB,et al.Downregulation of active caspase 8 as a mechanism of acquired TRAIL resistance in mismatch repair-proficient colon carcinoma cell lines［J］.Int J Oncol，2010，37（4）：1031-1041.

［9］Kisim A,Atmaca H,Cakar B,et al.Pretreatment with AT-101 enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced apoptosis of breast cancer cells by inducing death receptors 4 and5 protein levels［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（7）：1155-1163.

［10］DingJ,PolierG,KohlerR,etal.Wogoninandrelatednatural flavones overcome tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）protein resistance of tumors by down-regulation of c-FLIP protein and up-regulation of TRAIL receptor2expression［J］.J Biol Chem，2012，287（1）：641-649.