高侵襲性膠質瘤細胞轉移相關miRNA的芯片分析

李少一，高蕓，劉宏宇，王國棟，李曉東，馬維寧，劉云會

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，沈陽110001）

膠質瘤是人腦最常見的惡性腫瘤，約占40.49%，膠質瘤的特點是侵襲性強且容易復發(fā)。微小RNA（microRNA或miRNA）是指長度約21～25 nt的某些特殊的小型非編碼RNA組成的家族，這些miRNA能夠識別特定的目標mRNA，并在轉錄后水平通過促進靶mRNA的降解和（或）抑制翻譯過程而發(fā)揮負調控基因表達的作用［1］。近年來，其研究已經(jīng)從基礎研究迅速上升到臨床研究，研究證實miRNA參與諸多基因激活和失活的調節(jié)，逐漸成為腫瘤、心血管、免疫、炎癥等疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子標志［2～4］。miRNA作為腫瘤標志物，對預測人膠質瘤的侵襲轉移和臨床預后的相關研究還需要深入解析。腫瘤侵襲和轉移是主動過程，該過程可以概括為3個步驟：（1）腫瘤細胞與細胞外基質成分黏附；（2）腫瘤細胞釋放或誘導釋放蛋白水解酶，降解細胞外基質；（3）降解區(qū)域腫瘤細胞在趨化因子引導下遷移。腫瘤細胞必須啟動并成功地完成所有這些步驟才能進入循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)，形成遠隔轉移［5，6］。為了深入研究侵襲轉移步驟的機制，研究者建立了一些體外侵襲模型用于評估不同腫瘤細胞的侵襲活性［7，8］。為了深入了解轉移相關性miRNA表達的改變對人膠質瘤淋巴轉移的影響，我們從人類膠質瘤細胞系T98G中用Transwell侵襲小室技術通過體外篩選，建立了高侵襲性的膠質瘤細胞亞群（命名為T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。通過分析其在軟瓊脂中集落形成情況，比較幾種細胞亞群的體外集落形成能力，并采用miRNA芯片技術分析膠質瘤中與轉移密切相關的miRNA表達譜，旨在篩選與膠質瘤侵襲轉移密切相關的miRNA。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人膠質瘤細胞系T98G購自ATCC，細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2 Transwell體外侵襲實驗篩選高侵襲性的細胞亞群

用Transwell侵襲小室根據(jù)T98G細胞的侵襲性差異把他們分成不同細胞亞群。即用一種重新溶解配成原來濃度的基膜凝膠涂鋪Transwell有小插孔的聚碳酸酯膜（含8 μm孔）。將T98G細胞（5×104/孔）接種于Transwell小室上室，高侵襲性細胞消化基質膠后穿過Transwell小室聚碳酸酯膜上8 μm小孔進入小室下室，于37°C放置48 h后，收集高侵襲性細胞群。分別選出3個細胞亞群T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3。那些沒有移行至Transwell小室下室，停留在上室的細胞群，作為對照細胞命名為T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3。

1.3 軟瓊脂集落形成實驗

1×103個對數(shù)生長期T98G細胞懸浮于含0.3%軟瓊脂的完全培養(yǎng)液中，播種于1%底層軟瓊脂上（100 mm組織培養(yǎng)皿），放置37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中2周后，計數(shù)可見集落。

1.4 miRNA芯片分析

用Trizol（Invitrogen公司）提取RNA，委托博奧生物公司進行miRNA芯片分析。采用LuxScan10K激光共聚焦掃描儀掃描雜交芯片，并用LuxScan3.0軟件分析表達譜。采用Partek Genomics Suite分析表達譜結果，P<0.05、Fold Change>2為差異表達miRNA。

2 結果

2.1 T98G細胞亞群的成瘤性比較

利用Transwell小室，根據(jù)其侵襲性的差異，將人類的膠質瘤細胞株T98G分為2個不同的細胞亞群。穿過基質膜的細胞作為高侵襲性的細胞亞群（T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。而那些留在小室上室的細胞亞群作為對照組（T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3）。用體外集落形成實驗來檢測選定的細胞亞群的成瘤性。如圖1所示，在軟瓊脂上的T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3細胞亞群，形成的集落數(shù)量分別是對照組的2.7、3.4和3.2倍。

2.2 與人膠質瘤T98G細胞侵襲轉移密切相關的miRNA表達譜

為了解析參與調控膠質瘤侵襲轉移的miRNA，我們分析了高侵襲性細胞亞群與對照組的表達有差異的miRNA。如表1顯示，高侵襲性細胞亞群與對照細胞亞群比較，采用Partek Genomics Suite分析表達譜結果，有11個miRNA的表達有顯著差異（P<0.05，F(xiàn)old Change>2），其中5個miRNA的表達上調（let-7b、miR-200A、miR-222、miR-106 和 miR-193）和6個miRNA的表達下調（mir-199B、mir-26A、mir-34、miR-29、mir-15A 和 mir-16）。

3 討論

至今我們對腫瘤惡性轉化及侵襲轉移演變過程的了解還很有限，本研究采用Transwell侵襲小室，從人膠質瘤細胞株T98G中篩選出高侵襲及轉移潛能的細胞亞群。結果顯示，Transwell侵襲小室的體外篩選是一個可行的方法，能夠分離不同惡性程度的細胞亞群，這些細胞亞群可用于進一步評估膠質瘤侵襲和轉移相關性的研究。為了鑒別miRNA表達譜有顯著差異，我們通過微點陣分析3個不同的高侵襲性亞群和對照亞群，并獲得了與轉移相關的miRNA差異表達圖譜。本研究所用的所有細胞系均來自同一母細胞系，因此他們有相同的遺傳背景，但有不同轉移潛能。當我們比較侵襲性亞群和對照亞群時，我們鑒別出11個差異性調節(jié)miRNA。在高轉移的細胞亞群與對照組間，已確定存在差異表達的11個 miRNA 中，有 9個 miRNA（let-7b、mir-222、mir-106、mir-193、mir-34、mir-29、mir-26a、mir-15a 和mir-200）在腫瘤細胞轉移的進展中及間質上皮的轉變發(fā)揮了重要作用［9～12］；而mir-199B和mir-16分別涉及腫瘤干細胞的分化及凋亡［13，14］。

miRNA在不同組織、不同發(fā)育階段中的表達水平有顯著差異，miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性，而且miRNA作為一種廣泛存在的對基因表達進行微調的分子，通過網(wǎng)絡式調控方式，可以從整體上調控有機體的生命活動。在本研究中我們獲得了關于轉移相關的miRNA差異表達的相關信息，提示這些miRNA可能顯著影響腫瘤轉移及惡性轉化。因此需要進一步研究以確定miRNA差異表達的分子機制，并探究這些miRNA如何促進腫瘤轉移。

［1］Landgraf P，Rusu M，Sheridan R，et al.A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing［J］.Cell，2007，129（7）：1401-1414.

［2］ Hassler M，Singh S，Yue WW，et al.Crystal structure of the retinoblastoma protein N domain provides insight into tumor suppression，ligand interaction，and holoprotein architecture［J］.Mol Cell，2007，28（3）：371-385.

［3］Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer［J］.Gastroenterology，2007，133（2）：647-658.

［4］Papagiannakopoulos T，Shapiro A，Kosik KS.MicroRNA-21 targets a network of key tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2008，68（19）：8164-8172.

［5］Fidler IJ，Kim SJ，Langley RR.The role of the organ microenvironmentinthebiologyandtherapyofcancermetastasis［J］.JCellBiochem，2007，101（4）：927-936.

［6］Bidard FC，Poupon MF.The metastatic process：history，models and recent advances［J］.Med Sci（Paris），2012，28（1）：89-95.

［7］史德剛，范鈺，朱夫，等.靶向survivin基因RNAi沉默表達對惡性膠質瘤細胞侵襲的影響［J］. 南方醫(yī)科大學學報，2009，29（5）：1156-1158.

［8］劉巍，晁騰飛，龔燕華，等.應用微陣列芯片分析人髓母細胞瘤及瘤旁組織 miRNA 表達譜差異［J］.首都醫(yī)科大學學報，2009，30（3）：355-359.

［9］Nikiforova MN，Tseng GC，Steward D.MicroRNA expression profiling of thyroid tumors：biological significance and diagnostic utility［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93（5）：1600-1608.

［10］Gregory PA，Bracken CP，Bert AG，et al.MicroRNAs as regulators of epithelial-mesenchymal transition［J］.Cell Cycle，2008，7（20）：3112-3118.

［11］Korpal M，Kang Y.The emerging role of miR-200 family of microRNAs in epithelial-mesenchymal transition and cancer metastasis［J］.RNA Biol，2008，5（3）：115-119.

［12］Gebeshuber CA，Zatloukal K，Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin，which is a regulator of epithelial polarity and metastasis［J］.EMBO Rep，2009，10（4）：400-405.

［13］Garzia L，Andolfo I，Cusanelli E，et al.MicroRNA-199b-5p impairs cancer stem cells through negative regulation of HES1 in medulloblastoma［J］.PLoS ONE，2009，4（3）：e4998.

［14］Guo CJ，Pan Q，Li DG，et al.miR-15b and miR-16 are implicated in activation of the rat hepatic stellate cell：An essential role for apoptosis［J］.J Hepatol，2009，50（4）：766-778.