雞梭菌性腸炎研究概論

朱良全，蔣玉文，彭 雋，孫 曄，李聰研

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100094;3.北京中海生物科技公司，北京 100081)

雞梭菌性腸炎(Clostridial Enteritis)由產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens，簡稱“Cp”)引起的壞死性腸炎(Necrotic Enteritis，簡稱“NE”)，又稱為梭狀芽孢桿菌腸炎菌群失調(diào)癥(dysbacteriosis)或小腸細菌生長過度癥(SIBO)。病死禽以肝腫大、腸道出血和腸黏膜有麩皮樣壞死灶為特征。隨著對抗生素類促生長劑的禁用，該病在全世界主要養(yǎng)禽的國家和地區(qū)都有發(fā)生，全球經(jīng)濟損失達20億美元［1］。

1 病原學

1930年，Bennetts在黑色Orpington小母雞損傷腸道中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌(又稱魏氏桿菌或魏氏梭菌)，雞感染該菌可導致死亡，后來被命名為“6日病”，受侵襲的雞腸道粘膜鑒定出產(chǎn)氣莢膜梭菌［2］。通過口服接種可在青年公雞復制腸道紊亂，通過鴉片(opium)治療可終止腸道運動。

壞死性腸炎主要由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，引起腸黏膜壞死等特征性病變，但C型不普遍。A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α毒素，C型還可產(chǎn)生β毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌是厭氧、產(chǎn)孢子、革蘭氏陽性大桿菌，通過IV型菌毛運動。它是脊椎動物腸道共棲菌，可從糞便污染的環(huán)境中分離到，也是環(huán)境中分布廣泛的病原菌［3］。染色體分析顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌缺乏產(chǎn)生13種必須氨基酸的遺傳結構，體內(nèi)主要通過外毒素的作用獲得，如一些酶等［4］。它可產(chǎn)生至少17種毒素或潛在毒性的外源蛋白，根據(jù)起主要致病作用的α、β、ε、ζ毒素可將其分為A～E 5個產(chǎn)毒素型(表1)［5］。大多數(shù)菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖;不發(fā)酵甘露醇;發(fā)酵的主要產(chǎn)物有乙酸和丁酸。液化明膠，石蕊牛乳陽性，吲哚陰性。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型

2 流行病學

NE菌株來源于雞本身，正常雞腸道永久地或暫時地定居著少量NE菌株。一些雞感染來自亞臨床病癥雞或排泄物污染的生存環(huán)境;一些雞腸道形成菌落叢，加上污染的褥草及其它環(huán)境面的污染使菌落呈指數(shù)增加。在雞群腸道合適條件下，爆發(fā)NE，將進一步增加感染［6－7］。對雞腸道內(nèi)容物中產(chǎn)氣莢膜梭菌進行檢測，75% ～95%為陽性，禽肉的陽性檢出率有時高達84%［8］。

NE發(fā)生與飼養(yǎng)中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染有關，當然蠅類傳播也有導致NE發(fā)生［9］;NE發(fā)生同時受到飼養(yǎng)管理壓力、高纖維褥草、限制飲食或禁食，甚至季節(jié)的影響［5］。另外梭菌性腸炎時常受到球蟲感染而惡化。早期壞死性腸炎主要與布魯氏球蟲和巨型球蟲感染有關，子孢子和裂殖子產(chǎn)生腸道粘膜傷害，并伴隨著腸道pH值下降、遷移時間提高，適宜產(chǎn)氣莢膜梭菌定植和繁殖［10］。感染艾美爾球蟲比未感染的無菌雞盲腸粘膜中產(chǎn)氣莢膜梭菌粘附率較高，感染梭菌和球蟲雞群死亡率比單獨感染梭菌至少高 25%［11］。

實驗室復制NE的關鍵因素及自然發(fā)病的主要危險因子在于感染有毒力的產(chǎn)氣莢膜梭菌和創(chuàng)造適宜厭氧菌繁殖的腸道環(huán)境。NE菌株毒力差異大，如禽壞死性腸炎和膽管肝炎的野外分離株常可復制出壞死性腸炎，但是其它許多推定為壞死性腸炎的分離株對雞是無毒力的(表2)［5，12］。腸道適宜環(huán)境通常是艾美爾球蟲感染或免疫球蟲苗后產(chǎn)生的腸道循環(huán)微環(huán)境的損害［10］。如共感染中，腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量和致死率是比較高的。另外是飲食因素。如飼料中添加50%魚粉，或添加易于在小腸中快速發(fā)酵的碳水化合物或蛋白，如小麥或大麥等［13］;再如食物中補充鋅也可提高艾美爾球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染率［14］;拌喂含有產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物或接觸畜群感染的褥草也可增加產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染率。雞免疫成熟年齡在3～4周齡，母源抗體持續(xù)3周，這也許是2～6周齡肉雞爆發(fā)高峰的原因;但也有報道，3～6月齡商品蛋雞和12～16周齡后備母雞亦有NE發(fā)生。

表2 壞死性腸炎模型中產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對雞的毒力

國外對雞群(健康和發(fā)病雞群)作產(chǎn)氣莢膜梭菌分型調(diào)查，對分離自丹麥25個雞場的279株菌和瑞典10個雞場的53株菌進行PCR分析，顯示所有菌株均為A型。進一步用PFGE(脈沖場凝膠電泳)分析，顯示同一健康雞群即使是同一個體都含有幾種不同的基因，然而遭受NE的雞卻只攜帶一到兩個產(chǎn)氣莢膜梭菌基因［15］。我國局部地區(qū)也有雞梭菌性腸炎的流行病學報道，2005年于洋等［16］對遼西地區(qū)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的12個雞場肉仔雞發(fā)病情況進行了調(diào)查，肉仔雞發(fā)病日齡為2～6日齡，地面平養(yǎng)，發(fā)病率為20% ～35%，發(fā)病后2～3日開始死亡，死亡率為30% ～80%。2009年倪學勤等［17－18］從對四川省地區(qū)規(guī)模化雞場采集的150份新鮮糞便樣品，分離到8株產(chǎn)氣莢膜梭菌(占整個樣品的5.3%)，多重PCR結果均為A型，分析四川地區(qū)健康雞群存在的產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是A型;另從四川省成都市、雅安市、宜賓市等地的10個規(guī)?；u場健康雞群的500個新鮮糞便和100個盲腸內(nèi)容物樣品中，分離得到34株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，分離率為5.7%。REP－PCR(基因組重復序列PCR)和AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)分析均顯示出了不同雞場產(chǎn)氣莢膜梭菌間的遺傳特性差異，即來源不同的菌株，在基因水平上表現(xiàn)出一定差異，為不同的基因亞型;而同一雞場的產(chǎn)氣莢膜梭菌主要聚為同一個群，表現(xiàn)亞型較單一，以某一種亞型為主，少數(shù)交叉其他亞型。與國外文獻報道相比，我國雞場產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的遺傳多樣性較低［19］。

3 癥狀及病變

雞梭菌性腸炎常見特征:精神沉郁、不愿意動、被毛皺褶，嗜睡、食欲廢絕，脫水，根據(jù)發(fā)病程度可分為2類。一是臨床癥狀型［6］:特急性病例通常1～2 h內(nèi)死亡，死亡率可達50%。大面積損傷主要表現(xiàn)在空腸和回腸，但有時在十二指腸和盲腸也出現(xiàn)。小面積損傷通常表現(xiàn)腸管擴張充氣，達正常腸管的2～3倍，腸壁薄而脆，腸道表面呈灰黑色或黑綠色，腸壁有出血斑點，但出血并不常見;腸粘膜壞死，呈大小不等、形狀不一的麩皮樣壞死灶，腸粘膜上附著有疏松或致密的偽膜，偽膜外觀呈黃色或綠色。自然發(fā)病病例特征性組織學病變是腸粘膜的嚴重壞死，最初病變集中發(fā)生于腸絨毛頂端，主要表現(xiàn)為上皮脫落，并伴有凝固性壞死，壞死區(qū)周圍有異嗜性細胞。病情稍長者，病變從絨毛頂端發(fā)展到隱窩，壞死可擴展到粘膜下層和肌層。絨毛和上皮崩解脫落，固有層充血，淋巴細胞增多，壞死灶底部成纖維細胞增生。二是亞臨床癥狀型:腸道中的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量超過正常值，但達不到引起發(fā)病的數(shù)量。主要特征為動物生產(chǎn)性能和飼料報酬降低，表現(xiàn)畜禽食欲變差、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長速度緩慢、腹瀉和腸黏膜的壞死。病理表現(xiàn)僅在腸黏膜有局部壞死。亞臨床感染有時還伴有肝炎或膽管性肝炎，眼觀雞肉色質(zhì)較差，黃疸、肝腫大發(fā)白，呈網(wǎng)狀，伴有白色星點狀病灶;組織病理學損害表現(xiàn)為膽管超常增生，呈纖維蛋白樣壞死，膽管炎，偶有局灶的肉芽腫［20］。

4 致病機理

產(chǎn)氣莢膜梭菌進入門脈循壞和膽汁管道，產(chǎn)生膽管肝炎，伴隨著蒼白、點狀損傷［6］。顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)在肝和膽管有大量的點聚集壞死，膽囊和肝外管充盈著濃重氣味的物質(zhì)，在壞死處出現(xiàn)革蘭氏陽性細菌菌毛，常見無膽汁和苦膽的肝炎［21］。

經(jīng)驗理論認為，所有A型菌株在適宜的雞腸道條件下均可產(chǎn)生壞死性腸炎的病癥和損傷，但在感染實驗模型中，一些來自健康雞正常菌群或其他動物腸炎的分離株對雞無毒力(表2)。誠然，如果腸道條件不適宜，即使是禽壞死性腸炎分離株也不能復制此病。退化的腸道運動性、腸道粘膜損傷及腸梗阻，加上飲食因素等條件，均有助于產(chǎn)氣莢膜梭菌生長［6］。雖然腸道中較高數(shù)量的產(chǎn)氣莢膜梭菌不足以產(chǎn)生壞死性腸炎，但感染壞死性腸炎每克粘膜含有106～108個菌落［10］。染色體序列分析可部分鑒定出毒力菌株的遺傳標志，遺傳學特征顯示健康雞含有2～5種基因型，感染壞死性腸炎或膽管肝炎呈現(xiàn)典型的單一基因型，在自然康復或治療康復雞中產(chǎn)生許多基因型，但無壞死性腸炎菌株的基因型，也許是壞死性腸炎菌株體外產(chǎn)生的細菌素起主導優(yōu)勢，抑制了非腸炎菌株生長［22］。

α毒素是鋅依賴性磷脂酶/神經(jīng)磷脂酶，一些證據(jù)表明α毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌致病感染中起關鍵作用。如在NE病雞禽糞中檢出比健康雞群較多的α毒素;α毒素突變體在鼠神經(jīng)壞死模型中毒力下降;免疫α毒素C－端結構域能產(chǎn)生抵抗致死劑量攻擊的中和抗體;少量健康雞含有α毒素抗體，NE康復雞含有高滴度α毒素抗體;NE雞群約15%～20%在孵化后5周血清陽性，至8周幾乎80%發(fā)生抗體轉(zhuǎn)化;新生雞含有α毒素抗體，高齡母雞含有較高水平的 α 毒素抗體［13－14，23］。不過 α毒素的作用先后受到Thompson、Keyburn、Coursodon等學者的質(zhì)疑［24－26］，如一些 α 毒素雞分離株突變體在體內(nèi)保持完全毒力，其對應的觀點顯示α毒素是保護性抗原［13，27］。再如發(fā)現(xiàn)由一種NetB毒素引起的壞死性腸炎，其氨基酸與β毒素存在38%同源性，與葡萄球菌α毒素存在31%同源性［28］;其自然和重組蛋白可引起細胞變圓和雞肝腫瘤細胞裂解，突變體不能復制出NE［28］。當然，關于NetB毒素最初報道中，25%誘發(fā)壞死性腸炎菌株的NetB毒素PCR和Western blot檢測陰性，而且少量雞接種NetB毒素突變體產(chǎn)生典型NE小面積損傷，因這些突變體不含有甲砜氯霉素抗性，結論是由環(huán)境或當?shù)豊etB毒素陰性株引起損傷［28］。因而推斷NetB毒素在菌株中也許是非必須的，Cooper和Songer的研究支持了上述結果［29］。但近幾年，NetB毒素為NE關鍵毒力因子理論逐漸占上風。2009年，Johansson等［30］對受到溫和NE影響的某一未曾飼喂過抗生素生長劑的后備肉雞群研究發(fā)現(xiàn)，該雞群流行NetB毒素且成基因多樣性(88株分離株通過脈沖場凝膠電泳出現(xiàn)32種不同的基因型)。2009年，Abildgaard［31］從丹麥肉雞場分離出48株A型菌株，NetB毒素基因在NE雞群及健康雞群分離株中分別占60%及50%;含有NetB基因菌株啟動子區(qū)域保守，少許菌株編碼基因變異;分離菌株體外培養(yǎng)，NE雞群中12/13株NetB毒素基因檢測陽性，而健康雞群中4/14株NetB毒素基因陽性。2010年，Keyburn等［32］對54株來自澳大利亞、比利時、丹麥、加拿大NE雞群分離株，55株來自澳大利亞、比利時健康雞群分離株研究發(fā)現(xiàn)，NE分離株中70%NetB毒素檢測陽性，而健康分離株僅2株檢測陽性，而且NE分離株中NetB毒素基因序列高度保守，NetB毒素陰性的NE分離株在動物模型上不能誘發(fā)壞死性腸炎，表明NetB毒素是NE的關鍵毒力因子。但2010年Lanckriet等［33］研究卻認為α毒素和NetB毒素均不一定為免疫保護力的關鍵因子。他們對含有α毒素和NetB毒素的8株NE田間分離株研究發(fā)現(xiàn)，僅1株菌株培養(yǎng)上清產(chǎn)物對強毒攻毒產(chǎn)生完全保護，1株產(chǎn)生部分保護，其它均不保護。

飲食是誘發(fā)壞死性腸炎的最重要的非細菌因素。能量高、蛋白豐富的飼料(如動物蛋白)易于發(fā)生NE，吃小麥或大麥NE發(fā)生率比吃玉米高6～10倍，死亡率高2～3倍，微生物在體外消化的麥類中比谷類更易增殖［6，34］;另外食用馬鈴薯類蛋白比大豆類蛋白攝入率及生長率分別低7.7%及7.8%，但其誘發(fā)腸道壞死率高(馬鈴薯類蛋白為23.6%，大豆類蛋白為15.3%)［35］;大豆蛋白保持最低胰蛋白酶抑制劑的活力有助于雞群健康［36］。飼料成分的類型也影響NE發(fā)生，顆粒性飼料比蛋白粉料更易產(chǎn)生負面作用，顆粒性飼料的生產(chǎn)率較高，但較小的顆粒更易于雞消化及產(chǎn)氣莢膜梭菌利用［37］。

5 診斷

根據(jù)流行病學、臨床癥狀、病理變化及實驗室檢驗進行診斷。注意本病與潰瘍性腸炎和小腸球蟲感染相鑒別。潰瘍性腸炎特征性剖檢病變?yōu)樾∧c遠端及盲腸上有多處壞死和潰瘍灶，肝也有壞死灶;壞死性腸炎的病變?yōu)榍捌谀c道充氣擴張，中后期廣泛性粘膜壞死，僅局限于空腸和回腸，不累及盲腸，脾不腫大而盲腸、肝幾乎無病變;小腸球蟲病特征在于腸腔內(nèi)充滿血凝塊或粘液粘膜增厚，通過鏡檢可發(fā)現(xiàn)處于不同發(fā)育期的球蟲［38］。

6 治療及預防

由于產(chǎn)氣莢膜菌是腸道正常寄生菌，發(fā)病的誘因主要是其過分繁殖或引起機體免疫抑制、抗病力降低而引起。所以控制誘因是防制本病的重要措施。1)注意季節(jié)變化，春、夏季易發(fā)病。2)加強糞便、土壤、墊料、飼料等衛(wèi)生清理。3)減少高能量、高蛋白質(zhì)日糧攝入。4)利用細菌之間的競爭性排斥。通過建立腸道正常菌群從而限制產(chǎn)氣莢膜菌的繁殖以減少發(fā)病。如枯草桿菌孢子可競爭地排除肉雞中的產(chǎn)氣莢膜梭菌，乳酸桿菌、糞鏈球菌能抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的繁殖，可減少壞死性腸炎的危害;有些益生菌(Probiotics)能降低胃腸道pH值，有利于腸道內(nèi)共生菌生長繁殖，抑制病原菌生長繁殖。如飼料中增加β－甘露聚糖酶可減少NE損傷［6］。5)預防與控制好免疫抑制病。如馬立克氏病、傳染性法氏囊病、傳染性貧血和J－亞型淋巴白血病等。6)加強飼養(yǎng)管理。適宜飼養(yǎng)密度及減少環(huán)境應激，可降低本病發(fā)生。7)飼料中可適當添加維生素，特別是維生素B，因它是一種抗氧化劑，可有效保護細胞膜，減少小腸黏膜壞死損傷。8)使用多醚離子載體類抗球蟲藥物，不但能作用于球蟲同時也能作用于本病原菌，減少本病的發(fā)生率。9)合理并慎重使用抗生素。通過在飲用水中添加潔霉素、桿菌肽鋅、土霉素、青霉素和泰樂菌素或者在食物中添加桿菌肽鋅、潔霉素、維及尼霉素、青霉素、阿佛帕星和雙呋咪腙等來防治。但由于動物食物中一些抗菌耐藥性病原會轉(zhuǎn)移給人［39］。如最重要的萬古霉素抗性腸球菌(VRE)，在歐美醫(yī)療機構中成為主要問題。在禽畜飼料中使用奧沃霉素引起VRE在食用動物中的匯集，導致VRE在人體中的產(chǎn)生和傳播［40－41］。因而歐共體取消了在飼料中使用抗生素生長促進劑［6］，從而使VRE在食用動物中的發(fā)生率大大降低，但導致NE爆發(fā)的增加，特別是在西歐，譬如法國NE的發(fā)生率從1995年的4%上升到 1999 年的12.4%［11］。另外，2009 年 Nowell等［42］從加拿大零售肉雞中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)21%壞死性腸炎分離株含有NetB毒素基因，該基因可通過肉雞傳遞給人。所以此法應慎重使用。綜上所述，目前最實用的方法是通過抗病育種、加強飼養(yǎng)管理、優(yōu)化飼料配方、控制球蟲病和免疫抑制病的發(fā)生等來預防本病。

7 免疫

在免疫學上，鑒定了一系列免疫原性蛋白，開展了血清學及免疫效力等相關研究。盡管暫不能完全解決NE問題，但是預示不久會有好的方法。

在NE免疫血清學抗體中，通過反向遺傳方法鑒定毒力菌株產(chǎn)生的5種免疫原性蛋白。A型毒素(CPA)、甘油醛－3－磷酸鹽脫氫酶、丙酮酸鹽∶鐵氧還蛋白－氧化還原酶(PFOR)、果糖1，6－二磷酸縮醛酶(FBA)和假想蛋白(HP)等5種組氨酸標記表達產(chǎn)物免疫肉雞。每種蛋白均能對溫和毒株攻毒提供顯著保護力，而CPA、HP和PFOR能對較強毒株攻毒提供顯著保護力。產(chǎn)氣莢膜梭菌A型類毒素初次免疫，用活性毒素加強免疫，能夠?qū)姸局旯ザ咎峁┳畲蟊Ｗo。口服免疫無毒沙門氏菌載體攜帶FBA或HP基因疫苗也有顯著保護作用。CPA的C－末端片斷被克隆入減毒沙門氏菌載體疫苗(RASV，其中pabA和pabB基因被刪除突變?yōu)槿醵局?。肉雞連續(xù)3 d口服免疫109CFU重組疫苗，可產(chǎn)生CPA－中和抗體，經(jīng)過攻毒發(fā)現(xiàn)免疫后的肉雞小腸粘膜損傷降低。另外Kyungwoo Lee［43］鑒定出延伸因子 Tu(elongationfactor Tu，簡稱“EF－Tu”)和PFOR為產(chǎn)氣莢膜梭菌粘附感染肉雞相關的兩種免疫原性蛋白。

肉用種母雞免疫A型和C型類毒素可產(chǎn)生較強的IgY血清抗體反應，并可傳遞給后代;雖然A型抗體應答高于C型，但免疫C型類毒素對亞臨床NE和肝炎肉雞保護效果更為顯著［28］。肉雞免疫重組α毒素可提供對強毒部分［23］或完全的保護。肉雞分別在第5天和第15天皮下接種重組α毒素，在第25天攻毒，免疫雞發(fā)生NE的幾率顯著低于未免疫雞。小雞接種有毒力的產(chǎn)氣莢膜梭菌株(1次/d，連續(xù)5 d)，然后經(jīng)桿菌肽治療，可免受強毒再次攻擊。當然也有一些不同發(fā)現(xiàn)，接種α毒素缺失突變體也能夠起到免疫保護作用。2010年，Crouch等［44］運用NetvaxTM公司的A型類毒素與輕質(zhì)礦物油乳化成苗，肌肉注射免疫接種肉種母雞安全，精神狀態(tài)和生產(chǎn)性能無全身副反應，可明顯減少由NE引起的后代仔雞的死亡和腸道損傷。2011年，Saleh等［45］運用當?shù)亓餍卸局曛苽銩型、C型及A+C型類毒素，皮下注射免疫7日齡商品肉雞，0.5 mL/只，21日齡以同樣劑量及途徑加免一次，在35日齡進行混喂(2 L產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物+1 kg飼料或1 L產(chǎn)氣莢膜梭菌肉湯培養(yǎng)物+2 L水)攻毒，通過全血計數(shù)(complete bloodcount，簡稱“CBC”)、白細胞計數(shù)、ELISA 抗體檢測等結果證明免疫雞(特別免疫A+C型類毒素)腸道損傷明顯下降。非常有趣的是我們曾將A或C型類毒素用20%氫氧化鋁膠配成疫苗后，皮下注射免疫14日齡肉雞，0.8 mL/只，14日后經(jīng)靜脈注射A或C型毒素進行攻毒，保護效果顯著，免疫雞均可達4/5～5/5保護，不免疫對照5/5死亡;但免疫14日齡或6周齡SPF雞，僅2/5保護，甚至不保護。這可能是SPF雞含有較高的經(jīng)蛋傳遞的母源抗體，這與Cooper和Songer報道［13］分析的結果一致。

8 展望

目前，禽類Cp污染的嚴重性和經(jīng)食物鏈向人類傳播的危險性備受關注，已提升為公共衛(wèi)生問題。過去數(shù)十年對于NE的病因?qū)W，發(fā)病機理的研究取得了很大的進展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，未來的研究將注重以下幾點:1)進一步明確產(chǎn)生NE的關鍵毒素因子。2)建立起一個合理的病理試驗模型，用于測試疾病防控措施。3)系統(tǒng)確定各種患病的風險因子，進行風險評估。4)深入研究禽類Cp定植和清除的機制以及其毒素產(chǎn)生的決定因素。5)基于高通量的細菌基因組測序和蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)類似NetB毒素的其他潛在毒素因子以及抑制毒素產(chǎn)生的藥物。6)進一步對蛋雞、肉雞及SPF雞群流行病學狀況進行深入的調(diào)查研究。7)深入開展標記疫苗及亞單位疫苗的研發(fā)，并對現(xiàn)有的類毒素疫苗的應用效果進行綜合評估，進一步完善NE系統(tǒng)防控措施。

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