反應(yīng)器細胞懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在動物疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

張 韌，王建超，陳文慶，劉華杰，高 飛，徐舸辰，林龍飛

(北京清大天一科技有限公司，北京 102200)

在我國，細胞反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在動物疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的研發(fā)和應(yīng)用正成為行業(yè)技術(shù)革新、產(chǎn)業(yè)升級的重要內(nèi)容。農(nóng)業(yè)部公告第1708號中明確規(guī)定，自2012年2月1日起，各省級獸醫(yī)行政管理部門停止對轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細胞苗生產(chǎn)線項目的獸藥GMP驗收申請。本文就反應(yīng)器細胞懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術(shù)在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生產(chǎn)中的國內(nèi)外應(yīng)用和發(fā)展情況進行了綜述，分析了動物疫苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢和我國疫苗產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級所面臨的機遇和挑戰(zhàn)。

1 反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

口蹄疫被認為家畜傳染性疾病中傳染性最強的一種疾病，國際獸醫(yī)局(OIE)將之列為A類傳染病。2010和2011年，在亞洲、非洲都有口蹄疫局部的爆發(fā)。接種安全、高效的疫苗是預(yù)防口蹄疫疫情發(fā)生的最有效策略之一。通常主要是通過濃縮技術(shù)提高口蹄疫疫苗的有效抗原量來實現(xiàn)其高效性;通過病毒純化工藝、有效的病毒滅活工藝來保證疫苗的安全性。反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒能顯著提高口蹄疫病毒抗原濃度。國際上先進的口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝都采用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細胞技術(shù)、有效的病毒純化工藝及二次病毒滅活工藝。當(dāng)前，面對國內(nèi)外嚴峻的口蹄疫防控形勢，高質(zhì)量的口蹄疫疫苗必將在口蹄疫防控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.1 國外應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 BHK21細胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世紀60年代，許多國家實驗室建立起了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)BHK21細胞繁殖口蹄疫病毒的生產(chǎn)系統(tǒng)［1］。1962年BHK21細胞懸浮培養(yǎng)成功，細胞增殖迅速，并成功應(yīng)用于口蹄疫病毒的生產(chǎn)［2］。反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒也就成為最普遍的口蹄疫疫苗生產(chǎn)方式，主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等國家［3］(表1)。印度口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)使用8000 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗，南美口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)一般采用3000～5000 L反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗，口蹄疫病毒抗原146S濃度大約在2 μg/mL。因為口蹄疫疫苗保護力與146S有正相關(guān)性，這些企業(yè)根據(jù)口蹄疫病毒146S來配制疫苗有效地保證了疫苗的質(zhì)量。

表1 國外部分懸浮培養(yǎng)BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗企業(yè)及其生產(chǎn)工藝

但是，這種20世紀60年代開發(fā)的口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝延續(xù)至今，存在許多技術(shù)上的缺陷。國外口蹄疫疫苗生產(chǎn)使用的BHK21細胞培養(yǎng)液是添加磷酸肉湯(Tryptose phosphate broth，TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate，LAH)的 GMEM及EMEM，再補加5% ～10%牛血清(表1)。不同批次間血清質(zhì)量差異引起細胞培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，導(dǎo)致影響疫苗生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和疫苗質(zhì)量。疫苗中殘留的血清蛋白使接種動物過敏反應(yīng)升高，一定程度上影響疫苗的安全性。在口蹄疫強制免疫的國家，牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗體的可能性，不僅影響病毒繁殖，而且可能導(dǎo)致口蹄疫病毒在抗體壓力下選擇性變異。牛血清中潛在污染朊病毒或瘋牛病病毒可給動物疫苗帶來潛在的生物危害，TPB或LAH等動物來源成份也存在安全隱患。為提升產(chǎn)品質(zhì)量及安全性，目前國外多數(shù)口蹄疫疫苗生產(chǎn)廠家急于將現(xiàn)使用的含血清生產(chǎn)工藝升級為不含血清生產(chǎn)工藝。

自從20世紀的80年代起，細胞培養(yǎng)基(液)發(fā)展迅速，低血清細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基、無血清無動物來源成分細胞培養(yǎng)基已商品化，為疫苗生產(chǎn)中少使用或不使用血清奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2 國內(nèi)應(yīng)用現(xiàn)狀 2008年，默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下簡稱“清大天一”)在國內(nèi)開發(fā)了BHK21低血清細胞培養(yǎng)基及反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21技術(shù)，并于2009年成功應(yīng)用到國內(nèi)一家口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)中。使用該工藝生產(chǎn)的口蹄疫抗原146S濃度可以達到3 μg/mL左右。該工藝全過程管道化操作，產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低，口蹄疫疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量顯著提高，同時生產(chǎn)成本下降30%［4－8］。

2009年，該公司成功開發(fā)了BHK21無血清無動物來源成分培養(yǎng)基和反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)BHK21細胞技術(shù)，并2010年成功應(yīng)用到國內(nèi)某口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)。相比于含血清懸浮培養(yǎng)工藝，無血清懸浮培養(yǎng)工藝具有巨大的技術(shù)優(yōu)勢。從種子庫復(fù)蘇BHK21細胞開始，到口蹄疫病毒繁殖、直至收獲的全過程，不添加任何的血清和動物來源成分，消除了血清抗體對病毒繁殖的干擾，同時減輕了純化壓力。無血清懸浮培養(yǎng)BHK21細胞的細胞密度可以達到5×106～6×106/mL以上，為生產(chǎn)高濃度口蹄疫疫苗奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

圖1是反應(yīng)器無血清培養(yǎng)BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒的工藝流程圖，相比于含血清口蹄疫病毒生產(chǎn)工藝，因?qū)崿F(xiàn)細胞無血清培養(yǎng)，工藝過程無需沉降換液。

圖1 4000L反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒工藝流程

目前國內(nèi)某企業(yè)使用該工藝生產(chǎn)的口蹄疫疫苗正處于報批階段，其他多家口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)及研究單位也在研發(fā)或?qū)で鬅o血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗的工藝。

2 反應(yīng)器細胞培養(yǎng)技術(shù)在禽流感病毒疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

50多年來，用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗的方法一直沿用至今，基本流程是將新的流感病毒株與適宜雞胚擴增的標(biāo)準實驗室毒株重配，制備并驗證疫苗株，隨后進行疫苗株的生產(chǎn)條件優(yōu)化和疫苗批量生產(chǎn)，這個過程約需要22周以上的時間［9］。雞胚禽流感工藝簡單、成熟，但存在缺陷:需要提前準備高質(zhì)量的受精雞胚，雞胚來源容易受到禽流感疫情的影響;單個受精雞胚通常生產(chǎn)一劑疫苗，效率較低，難以在短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn);為提高產(chǎn)量，需要進行疫苗株馴化過程［10］。正因如此，著名的市場調(diào)查資訊公司GBI Research在2011年發(fā)表研究報告指出，采用雞胚生產(chǎn)流感疫苗工藝將逐漸被細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝代替［11］。

采用反應(yīng)器培養(yǎng)細胞生產(chǎn)流感疫苗的過程大概需要12周時間［9］，發(fā)生突發(fā)疫情時，將細胞庫中凍存的細胞復(fù)蘇，細胞快速增殖進入規(guī)?；a(chǎn)疫苗，在生物安全三級環(huán)境下可以直接應(yīng)用野毒流行株進行疫苗生產(chǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MDCK、Vero等細胞對禽流感或流感病毒敏感，經(jīng)過工藝優(yōu)化，病毒滴度或HA效價并不低于雞胚。同時，反應(yīng)器細胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)流感疫苗的安全性和有效性，已有多種流感疫苗被美國FDA和歐洲EMEA批準上市(表2)［12－14］。細胞培養(yǎng)生產(chǎn)線自動化程度高，更容易疫苗的質(zhì)量控制。如，流水線管道化無菌生產(chǎn)、無外源因子污染;無卵清蛋白、易于純化;產(chǎn)品批間差小、純度高、安全性高。

表2 部分利用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行流感疫苗生產(chǎn)(研究)的企業(yè)

2.1 國外應(yīng)用現(xiàn)狀 國際上應(yīng)用反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感病毒生產(chǎn)的哺乳動物細胞主要有Vero細胞、MDCK細胞;用反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感病毒主要有PER.C6細胞、MDCK 33016細胞和AGE1.CR細胞。其中，美國百特生物科技公司(Baxter)的6000 L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)流感疫苗的平臺是一個非常成功的案例，能生產(chǎn)人或禽來源的 H1、H2、H3、H5、H7 和 H9 等各亞型毒株，對野生型的人H5N1病毒則有更高的生產(chǎn)效率［15］。其工藝流程:復(fù)蘇細胞庫的Vero細胞，經(jīng)方瓶和轉(zhuǎn)瓶擴增種子細胞，接種至生物反應(yīng)器中，經(jīng)過反應(yīng)器逐級放大至6000 L反應(yīng)器，控制細胞密度在2×106～3×106/mL，按一定的病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)接種病毒，病毒吸附l h后加入胰酶，32～35℃孵育48～72 h后收獲病毒液。

2.2 國內(nèi)應(yīng)用現(xiàn)狀 國內(nèi)禽流感疫苗或流感疫苗的生產(chǎn)工藝均采用雞胚生產(chǎn)工藝。國內(nèi)已有多家單位正在開發(fā)MDCK細胞、Vero細胞生產(chǎn)禽流感病毒疫苗工藝。因為PER.C6細胞、MDCK 33016細胞和AGE1.CR細胞都存在專利保護及許可使用等問題，應(yīng)用微載體培養(yǎng)MDCK細胞、Vero細胞成為一種現(xiàn)實的選擇。但對于禽流感病毒疫苗，至少1000 L規(guī)模以上的生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)病毒，該禽流感疫苗才有市場價值。采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞生產(chǎn)禽流感疫苗工藝過程中最大的困難是反應(yīng)器微載體培養(yǎng)細胞的逐級放大技術(shù)的開發(fā)。

清大天一自2009年開始進行反應(yīng)器微載體放大技術(shù)的研發(fā)工作，并于2011年獲得成功，實現(xiàn)了微載體培養(yǎng)細胞從10L–50L–120L–650L反應(yīng)器逐級放大培養(yǎng)MDCK細胞(圖2)、Vero細胞以及Marc145細胞、ST細胞等。

圖2 10L反應(yīng)器微載體培養(yǎng)MDCK細胞(100×)

篩選具有良好免疫原性又能在動物傳代細胞上繁殖的毒株也是禽流感疫苗生產(chǎn)工藝升級中的一個關(guān)鍵技術(shù)。國內(nèi)以高校、生物制品研究所等為首對該部分有較多的研究。目前，國內(nèi)禽流感病毒疫苗研究單位與微載體懸浮培養(yǎng)細胞工藝開發(fā)企業(yè)進行合作，在懸浮培養(yǎng)MDCK細胞生產(chǎn)禽流感病毒疫苗的工藝開發(fā)中已取得一定成果。同時清大天一與禽流感疫苗研發(fā)單位進行合作，采用cytodex－1微載體培養(yǎng)H5N1禽流感病毒，通過優(yōu)化工藝，H5N1的血凝(HA)效價能穩(wěn)定可達29以上，反應(yīng)器微載體培養(yǎng)的MDCK在接種H5N1禽流感72 h后的細胞大部分細胞已病變、脫落(圖3)。

圖3 感染禽流感病毒72hr的MDCK細胞(100×)

這些關(guān)鍵工藝技術(shù)的突破將為反應(yīng)器培養(yǎng)細胞生產(chǎn)禽流感疫苗的產(chǎn)業(yè)化奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

3 展望

從疫苗和懸浮培養(yǎng)的發(fā)展趨勢來看，反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)動物細胞技術(shù)、無血清細胞培養(yǎng)技術(shù)等是當(dāng)前世界范圍內(nèi)各大生物公司工業(yè)化生產(chǎn)疫苗的首要選擇。這些工藝技術(shù)的在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)用不僅能提高細胞高密度和疫苗抗原產(chǎn)量，而且規(guī)?；⒆詣踊姆磻?yīng)器疫苗生產(chǎn)平臺有效保證每批疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。疫苗產(chǎn)品的競爭實質(zhì)是不同生物制藥企業(yè)在其核心技術(shù)基礎(chǔ)上的疫苗質(zhì)量之爭，誰在未來掌握了反應(yīng)器疫苗生產(chǎn)工藝技術(shù)以及生產(chǎn)平臺，提高了效力和安全性等疫苗質(zhì)量，誰將會在下一輪行業(yè)發(fā)展中掌握市場主動權(quán)。過去幾年，我國動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用反應(yīng)器細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研發(fā)或生產(chǎn)口蹄疫、禽流感等疫苗方面發(fā)展迅速(表3)，這表明以反應(yīng)器工藝技術(shù)創(chuàng)新為基礎(chǔ)的疫苗質(zhì)量升級序幕已經(jīng)開始。

“建立疫苗和抗體的大規(guī)模和快速反應(yīng)生產(chǎn)新技術(shù)，系統(tǒng)的疫苗效果及質(zhì)量評價技術(shù)體系”是我國《十二五生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》中的發(fā)展重點之一。反應(yīng)器細胞培養(yǎng)工藝技術(shù)的革新是我國獸用生物制品行業(yè)升級換代的必然趨勢?？谔阋摺⑶萘鞲械葎游镆呙缟a(chǎn)技術(shù)升級正是當(dāng)時，通過應(yīng)用和發(fā)展反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)，甚至是無血清細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗，將不僅能提高我國疫苗質(zhì)量，有效地發(fā)揮疫苗在我國防控政策中基礎(chǔ)性作用，而且對推動我國從疫苗生產(chǎn)大國走向疫苗生產(chǎn)強國都有著重要的示范作用和社會意義。

表3 反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)在我國動物疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用概況

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