HPLC測定大鼠肝微粒體溫孵體系中二氫血根堿的含量

伍 勇，劉兆穎，姚芳芳，朱若岑，孫志良

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，長沙 410128)

血根堿是一種苯菲啶異喹啉類生物堿，主要存在于罌粟科、藍(lán)堇科及蕓香科的植物中，具有抗菌、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、增強免疫力、殺蟲及促進(jìn)動物生長等作用［1］。國內(nèi)外研究者已經(jīng)對血根堿的提取分離、藥理作用、毒理作用等方面開展了較深入的探索，但對血根堿的藥物代謝研究甚少，僅有一些以大鼠作為試驗動物的初步研究，從報道中僅獲知將大鼠灌胃血根堿后，二氫血根堿的生成是血根堿在體內(nèi)代謝的主要途徑［2］。同時，在血根堿轉(zhuǎn)變成二氫血根堿這個過程中，參與的代謝酶研究未見任何報道。因此，建立血根堿的代謝產(chǎn)物二氫血根堿的液相色譜測定法，為研究參與血根堿代謝的酶奠定基礎(chǔ)，亦為今后的臨床合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津2010AHT高效液相色譜儀(SIL－20A自動進(jìn)樣器、SPD－20A紫外－可見檢測器、LCSolution工作站)(島津企業(yè)管理(中國)有限公司);Hermle Z383K低溫高速離心機(德國HERMLE(中國)有限公司);Sartorius TE 212－L電子天平，感量0.0001 g(北京賽多利斯公司)。

1.1.2 試藥 血根堿(湖南美可達(dá)股份有限公司，批號20110626，純度＞98%);二氫血根堿(湖南美可達(dá)股份有限公司，批號20110428，純度＞98%);還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Roche公司，批號110322);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3 動物 成年健康雄性清潔級SD大鼠，體重180～220 g，長沙市東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供(實驗動物許可證號SCXK(湘)2009—0012)。

1.2 方法

1.2.1 鈣沉淀法制備肝微粒體 大鼠斷頭處死，用冰冷生理鹽水通過肝門靜脈灌洗肝臟后，紗布吸干水分稱重，再將肝組織剪碎片至1 cm3左右，然后加入4倍肝組織重量的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液制成20%(W/V)的勻漿液。所得勻漿液在6000 r/min，4℃離心20 min，所得上清液按1 mL加入88 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL的比例進(jìn)行混合，冰浴放置5 min后于14000 r/min，4℃離心15 min，沉淀為肝微粒體，適量0.05 mol/L Tris－HCl液(pH 7.4)重懸，－80℃保存?zhèn)溆?，并采用Bradford法測定肝微粒體蛋白濃度［3］。

1.2.2 定量方法

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱 SHIMADZU VPODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為水 － 乙腈 (37∶63，V/V);流速1 mL/min;檢測波長285 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制精密稱取二氫血根堿對照品0.0068 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻配成2 mmol/L二氫血根堿甲醇儲備溶液。然后加入空白肝微粒體，用0.05 mol/L Tris－HCl緩沖液 (pH 7.4)稀釋成1000、500、100、50、25 nmol/L 二氫血根堿溶液。

1.2.2.3 方法專屬性 分別設(shè)置空白肝微粒體組、空白肝微粒體加二氫血根堿組和生成二氫血根堿的溫孵反應(yīng)體系組，按1.2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。

1.2.2.4 最低檢測限 取二氫血根堿標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋成濃度較低的一組樣品，每個濃度測定5次，記錄每次測得的信號強度S與背景信號強度N，以能達(dá)到S/N=3時樣品的最低濃度為最低檢測限。

1.2.2.5 線性關(guān)系 將標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液按 1.2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(A)為橫坐標(biāo)，藥物濃度(C)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.6 精密度試驗 在肝微粒體溫孵液中加入二氫血根堿標(biāo)準(zhǔn)液，使二氫血根堿的濃度分別為50、100、500 nmol/L，按1.2.2.1 項下色譜條件測定二氫血根堿的日內(nèi)、日間RSD。

1.2.2.7 回收率試驗 配制二氫血根堿濃度分別為50、1000 nmol/L的肝微粒體樣品各5份，照1.2.2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。

1.2.2.8 穩(wěn)定性試驗 分別取 50、100、500 nmol/L二氫血根堿標(biāo)準(zhǔn)液，分別置室溫、－20℃反復(fù)凍溶3次，再測試其含量，考察其的穩(wěn)定性。

1.2.3 肝微粒體溫孵反應(yīng)體系與樣品處理 肝微粒體溫孵反應(yīng)體系總體積為300 μL，組成依次為:60 μL 蛋白濃度為10 mg/mL 的肝微粒體，30 μL 濃度為100 μmol/L 血根堿溶液，30 μL 濃度為 20 mmol/L NADPH 溶液，用 0.05 mol/L Tris－ HCl緩沖液(pH為7.4)加到所需體積。此反應(yīng)體系反應(yīng)后用等體積冰冷乙腈終止反應(yīng)，12000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm 的有機膜，濾液按色譜條件項下操作進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 從空白肝微粒體組、空白肝微粒體加二氫血根堿組和生成二氫血根堿的溫孵反應(yīng)體系組的色譜圖(圖1－圖3)可以看出，二氫血根堿峰形較好，與其他峰分離良好，且在肝微粒體中無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，說明本方法的專屬性較好。

2.2 最低檢測限 當(dāng) S/N≥3時，檢測限為10 nmol/L。

2.3 線性關(guān)系 在25～1000 nmol/L范圍內(nèi)，二氫血根堿(DHSA)的響應(yīng)與濃度成良好的線性關(guān)系。線性方程為 Y=33.5X+555.09，相關(guān)系數(shù) r=0.9996。

2.4 精密度 50、100、500 nmol/L 3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液其日內(nèi) RSD 分別為2.26%、2.57%、3.02%，日間 RSD 分別為 6.21%、4.33%、3.95%，滿足方法學(xué)的要求。

2.5 回收率 50、1000 nmol/L的二氫血根堿肝微粒體樣品回收率結(jié)果見表1，結(jié)果滿足方法學(xué)的要求。

表1 回收率測定結(jié)果(±s，n=5)

表1 回收率測定結(jié)果(±s，n=5)

加入量/(nmol·L －1)實測濃度/(nmol·L －1) 回收率/%50 50.86 ±1.30 101.72 ±2.60 1000 9882.02 ±26.28 98.82 ±2.63

2.6 穩(wěn)定性 50、100、500 nmol/L二氫血根堿標(biāo)準(zhǔn)液在不同條件的穩(wěn)定性考察結(jié)果見表2，表明二氫血根堿標(biāo)準(zhǔn)液在室溫與－20℃較穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(±s，n=5)

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(±s，n=5)

加入量/nmol·L －1)室溫實測濃度/(nmol·L －1)RSD/%－20℃實測濃度/(nmol·L －1)RSD/%50 49.05 ±1.17 2.39 50.13 ±3.19 6.37 100 98.42 ±2.61 2.65 97.86 ±5.11 5.22(500 493.38 ±14.21 2.88 487.90 ±15.52 3.18

3 討論

樣品處理方法優(yōu)化過程中，結(jié)合相關(guān)提取方法［4－6］，分別嘗試使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯進(jìn)行提取，對比發(fā)現(xiàn)甲醇沉淀蛋白不完全，乙酸乙酯提取率低，而乙腈的提取效率高，且峰形好。

本實驗建立的肝微粒體孵育體系中二氫血根堿的HPLC測定方法，在所用色譜條件下基線穩(wěn)定，二氫血根堿保留時間適中，與肝微粒體孵育體系中其他成分完全分離，且峰形好，具有快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可適用于血根堿在大鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物二氫血根堿的定量以及酶促反應(yīng)動力學(xué)研究。

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