抗HIF-1α和survivin基因雙靶位miR-RNAi載體的構(gòu)建及其對胰腺癌細胞的作用

徐孫兵，朱一平，牟一平，朱玲華

(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科，浙江杭州 310016)

胰腺癌是惡性程度較高的腫瘤之一，具有起病隱匿、早期診斷率低、易轉(zhuǎn)移、對放化療不敏感等特點。目前，手術(shù)是胰腺癌唯一有效的治療手段，但80%的患者在臨床發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)機會，因而迫切需要找到一種新的治療胰腺癌的方法。

隨著分子學研究機制的深入，研究者發(fā)現(xiàn)多種基因的異常表達與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。因此，以這些異常表達基因為靶點的治療有可能成為治療胰腺癌的有效方法。研究表明［2］，在胰腺癌的基因治療方案中，多基因聯(lián)合較以單基因為靶點的治療策略有更高的抑瘤效率。低氧誘導(dǎo)因子1的α基團(hypoxiainducible factor 1，alpha unit，HIF-1α)和存活素(survivin)在多數(shù)胰腺癌細胞中呈現(xiàn)高表達［3-4］。臨床和病理研究顯示［4-5］，HIF-1α 基因的過度表達與胰腺癌血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移以及腫瘤細胞的凋亡抑制顯著相關(guān)。survivin基因的表達水平與胰腺癌分期、患者預(yù)后以及放化療耐受等密切相關(guān)，顯示其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［6-8］。

在基因治療的手段中，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)具有操作簡便、作用穩(wěn)定、可以多基因為靶點的優(yōu)勢，是目前較為常用和可靠的基因敲除手段。在參與RNAi作用的媒介物中，微小RNA(micro RNA，miRNA，miR)相較于常用的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)具有無需與靶基因序列完全匹配、基因沉默環(huán)節(jié)較多和穩(wěn)定等優(yōu)勢［9］。

鑒于HIF-1α和survivin基因在胰腺癌病理機制中的重要作用，本研究構(gòu)建了具有聯(lián)合阻抑HIF-1α和survivin基因表達的雙靶位miR-RNAi載體，并利用其轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞Panc-1細胞株，評價其對胰腺癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 胰腺癌細胞Panc-1細胞株(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院中心實驗室保存)，RPMI 1640培養(yǎng)液(Cylone公司)，Opti-MEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)，MTT粉劑(Amresco公司)，二甲基亞砜(Sigma公司)，BLOCK-iTTMPolⅡmiR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP載體構(gòu)建試劑盒(Invitrogen公司)，PureLink HiPure Plasmid DNA miniprep Kit質(zhì)粒抽提試劑盒(Invitrogen公司)，TRizol試劑(Invitrogen公司)，BglⅡ、BamH Ⅰ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs公司)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)，兔抗人HIF-1α蛋白多克隆抗體(Bioworld公司)，兔抗人Survivin蛋白單克隆抗體(Cell signalling公司)，羊抗兔抗體(Bioworld公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng):Panc-1細胞于含10%胎牛血清、40 μg/ml鏈霉素和40 μg/ml青霉素 G的 RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染:對數(shù)生長期的細胞按照每孔5×105個接種于6孔板，培養(yǎng)過夜(覆蓋率約80%)。用Opti-MEN培養(yǎng)液輕洗細胞 2次，定容至 1.5 ml。分別用 250μL Opti-MEM 稀釋 4 μg 質(zhì)粒和 10μL lipofectamine 2000試劑，室溫孵育 5 min?；旌腺|(zhì)粒和lipofectamine 2000稀釋液，室溫靜置20 min。混合液加入各孔，培養(yǎng)5 h后，換為RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 寡核苷酸序列設(shè)計和合成 利用在線設(shè)計軟件RNAi designer設(shè)計寡核苷酸序列:4組對HIF-1α基因的mRNA(NM_181054)匹配的寡核苷酸序列(表1)和4組對survivin基因的mRNA(NM_001012271)匹配的寡核苷酸序列(表2)。陰性序列為實驗對照序列，在人類及小鼠基因組中均無同源序列(表1)。由Invitrogen公司合成裝載用的DNA單鏈。

表1 與HIF-1α基因mRNA匹配的寡核苷酸序列(seqI-IV)和對照序列(seqNeg)Table 1 Oligonucleotide sequences matching HIF-1α mRNA and control oligonucleotide

表2 與survivin基因mRNA匹配的寡核苷酸序列Table 2 Oligonucleotide sequences matching survivin mRNA

1.2.3 退火與裝載 按照BLOCK-iTTM載體構(gòu)建試劑盒說明書，將DNA單鏈用ddH2O稀釋到 100 μmol/L?；パa單鏈各 5μL，2μL 10 × 退火緩沖液，8μL ddH2O。95℃ 5 min，室溫 20 min，形成雙鏈DNA。將雙鏈DNA用ddH2O稀釋至10 nmol/L。在無菌EP管中，依次加入4μL 5 × 連接緩沖液，9μL ddH2O，2μL線性化pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR 質(zhì) 粒，4μL 10 nmol/L 雙鏈DNA，1μL T4 DNA 連接酶，輕輕混勻，室溫反應(yīng)30 min后置于冰上。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、抽提及鑒定 取5μL裝載反應(yīng)液加入100μL的DH5α感受態(tài)細胞中，冰上30 min，42℃熱休克45 s，再置于冰上2 min，加入1 ml的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，最后吸取100μL轉(zhuǎn)化液涂布于含 50 μg/ml壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。挑去4～5個陽性克隆，使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提，并送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2.5 雙靶點質(zhì)粒的串聯(lián)及鑒定 利用realtime RT-PCR，在抗 HIF-1α基因質(zhì)粒(anti-H)和抗survivin基因質(zhì)粒(anti-S)中各篩選出一個基因沉默效率最高的質(zhì)粒，再通過對pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR質(zhì)粒特殊限制性內(nèi)切酶識別位點的酶切和酶切片段的連接，串聯(lián)出抗HIF-1α和survivin基因雙靶位質(zhì)粒(anti-H+S，圖1)。串聯(lián)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5(感受態(tài)細胞，抽提后送Invirtrogen公司測序鑒定。

圖1 質(zhì)粒酶切位點及連接示意圖Fig.1 Plasmid restriction sites and chaining diagram

1.2.6 Real-time RT-PCR 檢測基因沉默效率按照Trizol說明書收集細胞總RNA?；旌? μg 總 RNA 和 1μL 10 μmol/L oligo dT(16)，DEPC 水定容至 10μL，70℃水浴變性 5 min，立即置冰上2 min。加入5μL反轉(zhuǎn)錄緩沖液，5μL 10 mmol/L dNTPs，1μL 40 u/μl RNAsin 和 1μL 200 u/μl M-MLV，DEPC 水定容至 25μL。至42℃水浴30 min，99℃水浴5 min破壞反轉(zhuǎn)錄酶，立即置冰上2 min，-20℃保存。

Real-time PCR 反應(yīng)體系:cDNA 2μL，10 ×PCR buffer 2.5μL，25 mmol/L Mg2+2μL，25 mmol/L dNTPs 0.2μL，上游引物(10 μmol/L)0.5μL、sybr green DNA 熒光染料(50 × )0.5μL，下游引物(10 μmol/L)0.5μL、Taq 酶(5 u/μl)0.3μL，用 ddH2O 定容至 25μL。反應(yīng)條件:95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，40個循環(huán);70℃ 5 min，4℃保持。HIF-1α上游引物為 5'-TCTCAAGGACCACCGCATCT-3'，下游引 物 為 5'-GCCAAGTCTGGCTCGTTCTCA-3'。Survivin上游引物為5'-TTGGCAGCAACGACA CAGAA-3'，下游引物5'-TCGGAAGGACTAGGT GTCT-3'。內(nèi)參基因為GAPDH，上游引物為5'-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3，下游引物為5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3。

基因沉默效率采用△△Ct來相對定量。根據(jù)靶基因和內(nèi)參基因(GAPDH)的 Ct值(threshold cycle number)計 算 出 △△Ct?！鳌鰿t=(待測樣品的目的基因的Ct平均值-待測樣本的內(nèi)參基因的Ct的平均值)-(對照樣品的目的基因的Ct的平均值-對照樣本的內(nèi)參基因的Ct的平均值)。靶基因的沉默效率為 1-2-△△Ct。

1.2.7 Western blot檢測目的蛋白表達 收集細胞，用組織蛋白裂解液冰上裂解30 min，13 000 r/min離心10 min。取上清加入上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。25 μg總蛋白經(jīng) SDSPAGE電泳(HIF-1α蛋白用10%SDS-PAGE，Survivin蛋白用15%SDS-PAGE)。250 mA恒流2 h后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，在適當位置剪開PVDF膜(將目的蛋白與GAPDH蛋白分在2張膜上)，含目的蛋白的膜加入一抗(HIF-1α抗體1∶1 000，約93 kD;Survivin 一抗 1∶1 000，約 17 kD)，4℃孵育過夜，1∶5 000稀釋的 HRP標記的羊抗兔抗體室溫孵育1 h。含GAPDH蛋白的膜加入1∶5 000稀釋的HRP標記抗體，室溫孵育1 h。ECL化學發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影。圖像采用Quantity One軟件進行半定量分析。

1.2.8 MTT法檢測Panc-1細胞增殖活性 胰酶消化80%融合狀態(tài)的細胞，以每孔3×103個接種于5塊96孔板，每板分為5組，每組設(shè)5個平行孔。5組分別為空白對照組、對照質(zhì)粒組、anti-H組、anti-S組和anti-H+S組，用相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔培養(yǎng)液200μL。轉(zhuǎn)染后即刻取出一塊，并每孔加入20μL 5 mg/ml MTT溶液，37℃孵育 4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入 150μL的DMSO進行顯色，用酶標儀于490 nm波長下檢測吸光度(OD490)，作為0 h數(shù)據(jù)，然后每隔24 h取出一塊進行相同處理，分析數(shù)據(jù)和繪制生長曲線。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用 SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。應(yīng)用單因素方差分析進行多組均數(shù)間的比較，應(yīng)用q檢驗進行兩兩間均數(shù)的比較。統(tǒng)計學檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒測序鑒定 將構(gòu)建完成的anti-H質(zhì)粒、anti-S質(zhì)粒和anti-H+S質(zhì)粒送測序后，比對測序結(jié)果與設(shè)計序列完全相同，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。依據(jù)插入序列不同將各質(zhì)粒依次命名為 anti-H(Ⅰ)-(Ⅳ)，anti-S(Ⅰ)-(Ⅳ)。其中anti-H+S質(zhì)粒由anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)串聯(lián)而成。

2.2 Real-time RT-PCR檢測靶基因的沉默效率

2.2.1 anti-H質(zhì)粒對HIF-1α基因的沉默效率將anti-H質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，24 h后收獲細胞進行Real-time RT-PCR，檢測HIF-1α基因mRNA的表達情況。4組質(zhì)粒對 HIF-1α基因的沉默效率分別為48%、2%、44%和30%。

2.2.2 anti-S質(zhì)粒對survivin基因的沉默效率將anti-S和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，24 h后收獲細胞進行Real-time RT-PCR，檢測survivin基因mRNA的表達情況。4組質(zhì)粒對survivin基因的沉默效率分別為72%、75%、58%和59%。

2.2.3 anti-H+S 質(zhì)粒對 HIF-1α 基因和survivin基因的沉默效率 根據(jù)real-time RTPCR結(jié)果，選擇對靶基因mRNA抑制作用最強的anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)進行串聯(lián)。anti-H+S和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染panc-1細胞，24 h后收獲細胞行Real-time RT-PCR，分別檢測HIF-1α和survivin基因mRNA的表達情況，結(jié)果顯示兩者的基因沉默效率分別為53%和42%。

2.3 Western blot檢測靶基因蛋白表達 將對照質(zhì)粒、anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)和 anti-H+S 轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，24 h后收獲細胞，提取總蛋白，行Western blot檢測靶蛋白表達情況(圖2)。anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)和 anti-H+S轉(zhuǎn)染組靶蛋白表達量與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比均明顯下降(P ＜0.05)。anti-H(Ⅰ)和 anti-S(Ⅱ)各自對其靶基因蛋白的下調(diào)作用與anti-H+S組相比無顯著性差異(P ＞0.05，表3)。

圖2 Western blot檢測靶基因蛋白表達Fig.2 Target gene expression detected by Western blot

表3 Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組靶蛋白表達量(灰度值比)Table 3 Gray value ratio of target proteins

2.4 MTT法檢測Panc-1細胞增殖活性 分別用 anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)、anti-H+S 和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1細胞。轉(zhuǎn)染后0 h各組增殖活性無顯著性差異。24 h起anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)和anti-H+S組增殖活性低于空白對照組和對照質(zhì)粒組(P＜0.05)。anti-H+S組從72 h起增殖活性明顯低于anti-H(Ⅰ)組和anti-S(Ⅱ)組(P ＜0.05)。而 anti-H(Ⅰ)和 anti-S(Ⅱ)組兩者間增殖活性始終沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05，表4、圖3)。

表4 Panc-1細胞各時間點吸光度值Table 4 OD value of Panc-1 cell line at each time point

3 討論

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，美國國立癌癥研究所(SEER)公布的數(shù)據(jù)顯示［10］，全美胰腺癌發(fā)病率和死亡率分別居所有惡性腫瘤的第10和第4位，并呈逐年增高趨勢。而缺乏有效的治療手段是造成晚期胰腺癌死亡率居高不下的重要原因。受惠于胰腺癌發(fā)病機制和基因技術(shù)的研究進展，利用RNAi技術(shù)聯(lián)合敲除多個致瘤基因的基因治療策略已顯示出良好的發(fā)展前景［2，11-12］。

圖3 Panc-1細胞生長曲線Fig.3 Growth curve of Panc-1 cell line

胰腺癌的發(fā)生與多條細胞通路異常密切相關(guān)［1］，細胞凋亡信號通路就是其中之一。Jones等［11］對24例胰腺癌樣本進行的基因組分析表明，所有胰腺癌細胞都具有與凋亡相關(guān)的基因突變。在細胞抗凋亡過程中起著關(guān)鍵作用的是凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，通過抑制 caspase3、7 和 9 活性來阻斷細胞凋亡。Survivin蛋白作為IAP家族中分子量最小的成員，在胰腺正常導(dǎo)管組織、低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變到胰腺導(dǎo)管細胞癌病灶中呈穩(wěn)定的指數(shù)增加，提示它與胰腺導(dǎo)管細胞惡變密切相關(guān)［3］。而體內(nèi)外研究也證實［6，8，13-14］，通過下調(diào) survivin 表達量，可以顯著抑制胰腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡并能增強放、化療的敏感性。本研究選擇survivin作為基因治療靶點之一，成功構(gòu)建了anti-S(Ⅱ)質(zhì)粒。而real time PCR和Western blot也證實，anti-S(Ⅱ)質(zhì)粒使Panc-1細胞survivin基因表達量顯著降低。生長實驗表明，anti-S(Ⅱ)質(zhì)粒明顯抑制了Panc-1細胞的增殖活力。

在胰腺癌發(fā)病機制中，除了凋亡信號通路的重要作用，耐缺氧和促血管生成機制也是不可或缺的因素［1］。缺氧狀態(tài)廣泛存在于實體腫瘤中，Koong等［15］早在2000年就證實了胰腺癌瘤體中存在缺氧情況，在7例胰腺癌患者細針穿刺樣本中，瘤體氧分壓中位數(shù)均低于5.3 mmHg，且24% ～90%的樣本低于2.5 mmHg;而相鄰的正常胰腺組織氧分壓介于24～92.7 mmHg，不到9%的樣本低于2.5 mmHg。胰腺癌耐受缺氧狀態(tài)與缺氧激活轉(zhuǎn)錄因子(hypoxiaactivated transcription factors)的高表達是分不開的［16］。HIF-1則是這些轉(zhuǎn)錄因子中最重要和最常見的成員之一，HIF-1α蛋白在不缺氧的情況下半衰期僅約5 min，而在缺氧組織中較穩(wěn)定。在正常胰腺組織中 HIF-1α表達較少(36.8%)，而在胰腺癌組織中則呈現(xiàn)高表達(70.8%)，在 腫 瘤 血 管 周 圍 更 加 明 顯［4-5］。HIF-1α高表達促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運子1(GLUT-1)等生成，增強血管內(nèi)皮生發(fā)作用，增加腫瘤細胞經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移和播散的風險，是胰腺癌預(yù)后的重要指標［16-17］。本研究成功構(gòu)建了anti-H(Ⅰ)質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染Panc-1細胞后抑制了細胞的增殖，證實了下調(diào)HIF-1α表達量在體外可達到阻抑胰腺癌生長的目的。

胰腺癌的發(fā)病機制涉及多條信號通路，單基因治療策略與基因聯(lián)合治療策略相比，在抑瘤效果上居于劣勢［2］。單獨阻抑survivin、HIF-1α基因或者單基因聯(lián)合放、化療的胰腺癌綜合治療實驗已見諸報道，并取得一定的治療效果，但聯(lián)合阻抑survivin和HIF-1α基因的研究目前尚未見報道。本研究成功構(gòu)建了anti-S質(zhì)粒和anti-H質(zhì)粒，并篩選出兩者中基因沉默效果最佳的2個，串聯(lián)出anti-H+S質(zhì)粒。anti-H+S轉(zhuǎn)染Panc-1細胞后使survivin和HIF-1α基因的mRNA及蛋白表達量明顯下降，顯示串聯(lián)質(zhì)粒構(gòu)建成功;生長實驗進一步表明，anti-H+S聯(lián)合阻抑上述2個基因的表達在抑制胰腺癌Panc-1細胞增殖上比單基因阻抑效果更明顯。

本研究中利用外源性miRNA在panc-1細胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi作用達到沉默靶基因目的。結(jié)果顯示，靶基因mRNA和蛋白在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后即有明顯的表達量下調(diào)，這可能是由于miRNA具有更為廣泛的基因沉默作用，它除了可介導(dǎo)類似于siRNA的mRNA核內(nèi)降解作用外，還能夠在細胞漿內(nèi)抑制mRNA的翻譯過程并誘導(dǎo)其核外降解過程［18］。從基因沉默穩(wěn)定性來看，生長試驗顯示，隨著時間的延長，處理組與對照組之間的差異更加顯著，顯示出miRNA表達質(zhì)粒在Panc-1細胞中瞬時轉(zhuǎn)染作用較為穩(wěn)定。而對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組增殖活性相較于空白對照組有所下降，提示miRNA質(zhì)粒對細胞存在一定的細胞毒性，這也為將來生物安全性研究提供了基礎(chǔ)。

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