IL-1β對人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9影響的體外研究

王娉婷 佟雪璐 陳新梅

目前約有18種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族成員可以在正常牙髓組織中檢測到[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥牙髓組織中，明膠酶MMP-9的水平有所增高[2]，提示其作為降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶系，可能在牙髓炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[3]。而其產(chǎn)生作用的具體途徑和機制目前尚不明確。由于細(xì)胞因子是MMPs酶原合成階段最主要的調(diào)節(jié)因素，而其中的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1是牙髓炎癥過程中最關(guān)鍵的介質(zhì)之一[4]。本研究利用免疫組化技術(shù)和明膠酶譜分析檢測經(jīng)IL-1β刺激的人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)和活性，初步探索在牙髓組織中IL-1β對MMP-9的合成和分泌的影響，為進一步研究MMPs在牙髓炎癥中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及接種 收集2006年4月—6月在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院因正畸原因完整拔除的健康前磨牙12顆，患者年齡18～25歲，無全身系統(tǒng)性疾病及關(guān)節(jié)炎病史。按以下方法培養(yǎng)原代牙髓成纖維細(xì)胞：75%乙醇擦拭拔除牙表面，用青、鏈霉素雙抗液浸洗，于超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）上劈開牙齒，取出牙髓，并剪掉根尖端1/3部分。將牙髓組織剪成1～2 mm3大小組織塊，移入離心管中，加入3 g/LⅠ型膠原酶（Sigma-Aldrich公司，美國）約3 mL，37℃搖床消化45～50 min后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入含有20%胎牛血清（Hyclone公司，美國）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）重新懸浮沉淀，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（SANYO-Mco17AIC，日本）靜置培養(yǎng)。取12例樣本源中細(xì)胞生長最為旺盛者用于傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)方法如下：待原代細(xì)胞貼壁后，隔日半量換液；細(xì)胞匯合后，采用胰蛋白酶消化法收集細(xì)胞，按1∶2傳代。選取生長良好的4～8代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔，接種于預(yù)先放置載玻片的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中備用。

1.2 免疫組化實驗 6孔板中每個孔內(nèi)的牙髓成纖維細(xì)胞為一個樣本，設(shè)實驗組和對照組各20個樣本。實驗組待細(xì)胞匯合至80%后，換為無血清培養(yǎng)基，同時加入IL-1β（PeproTech EC公司，英國），使其終濃度為10 μg/L，繼續(xù)孵育48 h后，多聚甲醛固定待檢；對照組更換培養(yǎng)基時不加入IL-1β，其余操作同實驗組。將2組樣本采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶免疫組化法（streptavidin peroxdase conjugated method，SP）處理：固定后的樣本滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫靜置20 min并去除多余液體后，滴加1∶150倍稀釋的兔抗人MMP-9單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），4℃下反應(yīng)過夜后用PBS清洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃下反應(yīng)30 min后用PBS清洗。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，反應(yīng)30 min后用PBS清洗。3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）顯色、蘇木素復(fù)染、明膠甘油封片后在倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）下觀察。用乳腺癌陽性片作陽性對照，用PBS代替第一抗體作陰性對照，MMP-9染色陽性細(xì)胞為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒，無著色即為陰性。每張細(xì)胞爬片顯微鏡下隨機讀取5個視野（×200），分別觀察實驗組和對照組中陽性細(xì)胞的比例，參考Nagel等[5]的方法進行分類：無陽性細(xì)胞為陰性，染色陽性細(xì)胞數(shù)<10%為弱陽性，10%～50%為中等陽性，>50%為強陽性。分別計數(shù)2組的分布頻數(shù)。

1.3 明膠酶譜實驗 與免疫組化實驗相同，6孔板中每個孔內(nèi)的牙髓成纖維細(xì)胞為一個樣本，設(shè)實驗組和對照組各20個樣本，分別對實驗組和對照組進行如下處理：實驗組待細(xì)胞匯合至80%后，換為含10%血清的培養(yǎng)基同時加入終濃度為10 μg/L的IL-1β，每隔48 h更換培養(yǎng)基以及IL-1β，分別收集第2、4、6、8、10天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液于微量離心（EP）管中，-80℃保存待檢；對照組更換培養(yǎng)基時，不加入IL-1β，其余操作同實驗組。配制8%分離膠和3.9%濃縮膠，以20 μL樣品上樣，以經(jīng)蛋白變性后的低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（華美生物工程公司）為陽性對照，該標(biāo)準(zhǔn)品含兔碳酸酐酶、牛血清白蛋白、兔肌動蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶，分別表達(dá)為相對分子質(zhì)量97 400，66 200，43 000，31 000，20 100，14400的6條條帶；以上樣緩沖液為陰性對照。在垂直電泳槽和電泳儀（Bio-Rad公司，美國）上以80 V、20 mA電泳30 min后，改為150 V，20 mA，電泳80 min。取出膠體置于2.5%Triton X-100（華美生物工程公司）洗脫液中震蕩30 min，重復(fù)2次。加入明膠緩沖液，37℃孵育48 h?？捡R斯亮蘭染色4 h，脫色，至出現(xiàn)明顯清晰的負(fù)染酶帶。用蒸餾水漂洗后觀察，通過計算機掃描圖像，Image-Pro Plus 6.0軟件測量累積光密度值（integrated optical density，IOD）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行分析。對免疫組化實驗結(jié)果，采用小樣本計數(shù)資料檢驗方法Mann-Whitney秩和檢驗比較實驗組與對照組的差異；對正態(tài)分布的計量資料以±s表示，并對每個觀測時間點的2組IOD值之間的差異采用t檢驗進行比較。檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 倒置相差顯微鏡下可見，在對照組人牙髓成纖維細(xì)胞中，大部分樣本中MMP-9的表達(dá)為陰性，見圖1，或者陽性細(xì)胞數(shù)<10%，僅個別樣本陽性細(xì)胞數(shù)為10%～50%。MMP-9染色陽性顆粒零散分布于細(xì)胞胞漿中，未見陽性細(xì)胞數(shù)>50%的樣本。實驗組的人牙髓成纖維細(xì)胞中，染色陽性顆粒主要分布于細(xì)胞胞漿中，少量分布于細(xì)胞外基質(zhì)中，見圖2。MMP-9陽性表達(dá)率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

Table 1 Results of immunohistochemistry between two groups表1 免疫組化法檢測結(jié)果 （n=20，例）

2.2 明膠酶譜分析 對照組和實驗組中均可檢測到MMP-9的酶原形式（分子質(zhì)量92 ku），而并未檢測到活化形式的MMP-9（分子質(zhì)量83 ku），見圖3、4。上清液中MMP-9表達(dá)對照組及實驗組IOD值隨培養(yǎng)時間的推移變化均不明顯，在所觀測的5個時間點，實驗組細(xì)胞MMP-9表達(dá)的IOD值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。

3 討論

在生理狀態(tài)下，牙髓中MMPs的水平較低，其與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）的平衡維持著牙髓組織的健康，而在炎癥牙髓組織中，一些MMPs的水平有所增高，其與TIMPs的平衡被打破，造成牙髓組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，尤其是膠原的降解。MMP-9即為炎癥牙髓中表達(dá)水平升高的MMPs之一，其主要定位在成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓成纖維細(xì)胞的胞漿中，且在某種程度上與牙髓炎患者的主觀癥狀相關(guān)，提示MMP-9可能在牙髓炎癥過程中發(fā)揮著重要作用，而目前對其作用機制和途徑尚不十分清楚。

Table 2 IOD values of gelatin zymogram of MMP-9 level in human pulp fibroblasts表2 人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9水平的明膠酶譜IOD值 （n=20，×103，±s）

Table 2 IOD values of gelatin zymogram of MMP-9 level in human pulp fibroblasts表2 人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9水平的明膠酶譜IOD值 （n=20，×103，±s）

**P<0.01

組別對照組實驗組t第2天15.42±1.63 18.26±1.80 5.230**第4天15.53±1.71 18.67±1.35 6.448**第6天15.47±1.59 22.34±1.51 14.020**第8天15.65±1.77 23.17±1.53 14.379**第10天15.63±1.34 23.88±1.62 17.553**

欲對MMP-9在牙髓炎癥中的作用機制及途徑進行深入探討，則需通過體外的細(xì)胞學(xué)實驗來完成。本研究即從MMPs酶原合成階段最主要的調(diào)節(jié)因素細(xì)胞因子入手，檢驗牙髓炎中最重要的介質(zhì)IL-1對體外培養(yǎng)的人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響，并對其在體外細(xì)胞系中的表達(dá)定位情況進行觀察。

本研究采用SP法檢測體外培養(yǎng)的人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)，結(jié)果顯示對照組人牙髓成纖維細(xì)胞中，大部分樣本MMP-9的表達(dá)呈陰性，僅少數(shù)樣本中可見散在的免疫組化染色陽性顆粒，證實在生理狀態(tài)下MMP-9的表達(dá)量極少，可能僅以酶原形式少量存在于細(xì)胞胞漿中。而經(jīng)IL-1β刺激后的實驗組人牙髓成纖維細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)顯著增高，染色陽性顆粒主要分布于細(xì)胞胞漿中，少量分布于細(xì)胞外基質(zhì)中，這符合MMPs作為胞外酶的生物學(xué)特性，它主要在細(xì)胞內(nèi)合成并分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用，而IL-1β能夠使人牙髓成纖維細(xì)胞合成和分泌至細(xì)胞外的MMP-9的量增多，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符[6]。

明膠酶譜法是測定明膠酶（MMP-2、-9）表達(dá)和活性常用的方法，其專一性強、操作簡便、適用范圍廣，被廣泛用于MMPs的活性測定。本實驗中其作為免疫組化定性分析的進一步補充。結(jié)果顯示，對照組人牙髓成纖維細(xì)胞中，MMP-9的表達(dá)量較低，條帶模糊不清，隨培養(yǎng)時間的變化不明顯，實驗組與對照組MMP-9表達(dá)水平的差異雖然具有統(tǒng)計學(xué)意義，但I(xiàn)OD值相差并不懸殊，表明MMP-9在牙髓成纖維細(xì)胞中的表達(dá)總量較低。加之MMP-9缺乏降解Ⅰ型和Ⅲ型膠原的能力，故可以認(rèn)為MMP-9在牙髓炎癥基質(zhì)降解中可能僅起輔助作用。

明膠酶是以酶原形式分泌的，其活性中心位于催化結(jié)構(gòu)域，在某些激活劑的作用下，前肽區(qū)水解或變構(gòu)，使酶的活性中心暴露，從而使MMPs激活，只有活化后的MMPs才具有降解基質(zhì)蛋白的功能[7]。本實驗明膠酶譜分析僅檢測到MMP-9酶原形式，推測其原因可能是由于樣本中活性酶的含量較少，不易檢測到。這提示IL-1β可能僅調(diào)節(jié)MMPs的合成和分泌，并未參與MMPs的激活，但這還缺乏有力證據(jù)。近年來的研究顯示，IL-1β對MMPs的作用可能是通過刺激原癌基因產(chǎn)物C-Fos的表達(dá)來實現(xiàn)的，C-Fos作為轉(zhuǎn)化激活因子與MMPs基因的啟動區(qū)活化蛋白-1（Activator Protein-1，AP-1）結(jié)合位點相結(jié)合，促進其基因轉(zhuǎn)錄[8]，進而促進人牙髓成纖維細(xì)胞中MMPs的合成和分泌。其中的具體作用機制仍有待進一步研究。

Figure 1 Expression of MMP-9 in control group(by inverted phase contrast microscope×200)圖1 對照組MMP-9的表達(dá)（倒置相差顯微鏡×200）

Figure 2 Expression of MMP-9 in experimental group(by inverted phase contrast microscope×200)圖2 實驗組MMP-9的表達(dá)（倒置相差顯微鏡×200）

Figure 3 Gelatin zymogram of control group圖3 對照組明膠酶譜

Figure 4 Gelatin zymogram of experimental group圖4 實驗組明膠酶譜

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