海篷子籽油制備共軛亞油酸及其組分分析

潘群文 陳美珍 吳 演

海篷子籽油制備共軛亞油酸及其組分分析

潘群文 陳美珍 吳 演

(汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系，汕頭 515063)

研究海篷子籽油中亞油酸轉(zhuǎn)化制備共軛亞油酸的工藝條件。以海篷子籽油為原料，KOH為催化劑，乙二醇為溶劑，堿異構(gòu)法轉(zhuǎn)化共軛亞油酸。采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選海篷子籽油共軛亞油酸的最佳制備技術(shù)條件。結(jié)果表明海篷子籽油是制備共軛亞油酸的良好原料，所得產(chǎn)品中共軛亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)87%以上，共軛亞油酸兩種活性異構(gòu)體9c，11t－CLA和10t，12c－CLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)68%以上。用海篷子籽油制備共軛亞油酸最適條件為:反應(yīng)溫度在180℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，溶劑用量為油質(zhì)量的2倍，催化劑用量為籽油質(zhì)量的25%。本研究所優(yōu)選的工藝條件可使籽油中亞油酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)94．6%，所制得的海篷子共軛亞油酸產(chǎn)品的各項(xiàng)理化指標(biāo)接近食用油標(biāo)準(zhǔn)，工藝條件實(shí)際可行，制備的共軛亞油酸產(chǎn)品安全無(wú)毒，有望開(kāi)發(fā)成一種高附加值的保健食用油。

海篷子 亞油酸 共軛亞油酸 氣相色譜 堿異構(gòu)化

共軛亞油酸(Conjugated Linolei Acid，CLA)，是必需脂肪酸亞油酸衍生的共軛雙烯的多種位置與空間異構(gòu)體的總稱(chēng)［1］，主要有 9c，11t、10t，12c、9t，11c和 9t，11t等［2］，其中 9c，11t－ CLA 和 10t，12c － CLA被證實(shí)具有生理活性［3－4］。CLA在230～233 nm 處有最大吸收峰，而亞油酸沒(méi)有［5］。天然存在的CLA不多，目前主要是利用亞油酸堿催化共軛化反應(yīng)或酶催化異構(gòu)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化獲得［6－8］。共軛亞油酸是一種新發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)素，具有顯著的抗腫瘤、降低人體血脂水平和脂肪含量、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增加肌肉、提高免疫力、合成前列腺素和防治糖尿病等多種重要的生理功能［9］。CLA食品補(bǔ)充劑近期已在美國(guó)上市，是美國(guó)食品學(xué)會(huì)推薦的流行補(bǔ)充劑之一。我國(guó)2009年已經(jīng)將共軛亞油酸批準(zhǔn)為功能食品，CLA的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

海篷子是近年從北美引進(jìn)的海水蔬菜，目前在我國(guó)南方沿海灘涂正在大規(guī)模栽培，其種子含油量高達(dá)33%，籽油中亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)73．52%，適宜作為制備CLA的原料，因此本研究以海篷子籽油為原料，堿異構(gòu)法轉(zhuǎn)化共軛亞油酸，采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選海篷子籽油共軛亞油酸的最佳制備技術(shù)條件，以期為海篷子的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1．1 原料與試劑

海篷子籽油:汕頭大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)經(jīng)氣相色譜測(cè)定73．52%;三氟化硼甲醇溶液(化學(xué)純):上?；瘜W(xué)試劑公司;正己烷(色譜純):廣州市西隴化工試劑有限公司，亞油酸甲酯、共軛亞油酸甲酯(9c，11t－ CLA、10t，12c－ CLA 混合樣)(色譜純):NU－CHEK。

1．2 儀器和設(shè)備

UV－2100型紫外分光光度計(jì):龍尼柯儀器有限公司;OSB－2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海愛(ài)朗儀器有限公司;HL－5多功能攪拌器:常州國(guó)華電器有限公司;GC－17A氣相色譜儀:日本島津有限公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 油脂的共軛化

取40 g乙二醇，置于燒瓶中，加入5 g催化劑加熱溶解，稱(chēng)取20 g海篷子籽油加入上述溶液中，分別于一定溫度下反應(yīng)4 h。反應(yīng)溫度降至80℃時(shí)，經(jīng)酸中和，蒸餾水洗至中性后，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，制得含CLA的混合脂肪酸。

共軛轉(zhuǎn)化率計(jì)算為:CLA/LA×100%

式中:CLA為產(chǎn)品中共軛亞油酸含量;LA為籽油中亞油酸含量。

共軛亞油酸產(chǎn)品相關(guān)理化指標(biāo)測(cè)定 過(guò)氧化值按照GB/T5538—2005測(cè)定、皂化價(jià)按照GB/T 5534—2008測(cè)定、碘價(jià)按照GB/T 5532—2008測(cè)定。

1．3．2 共軛亞油酸的檢測(cè)方法

紫外分光光度法［10］:取催化反應(yīng)所得海篷子共軛化油0．1 g于10 mL試管中，用正己烷稀釋到5 mL，搖勻，移取5μL于10 mL試管中，振蕩搖勻備用，采用紫外分光光度計(jì)法，以純正己烷作參比，在190～300 nm處進(jìn)行全波段掃描，查看在231～233 nm間是否有最大吸收峰，如果有最大吸收峰出現(xiàn)，證明亞油酸已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)楣曹梺営退帷?/p>

1．3．3 共軛亞油酸組分分析

采用氣相色譜分析。

1．3．3．1 氣相色譜分析條件

檢測(cè)器為FID。色譜柱:DB－WAX(20 m×0．25 mm，0．25 μm);升溫程序:140 ℃ 保持 4 min，以30℃/min升至230℃，保持10 min;載氣(N2)流速1．26 mL/min，壓力 127 kPa，進(jìn)樣量 1 μL;分流比1∶30。

1．3．3．2 脂肪酸甲酯制備方法［11］

取30 mg脂肪酸放入10 mL具塞試管中，在試管中加入2 mL氫氧化鈉甲醇溶液，充氮?dú)?。在振蕩器上振蕩，混勻，置?0℃水浴中振蕩15～30 min(約5 min取出振蕩)，至油滴消失，趁熱在試管中加入2 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，充氮?dú)猓鰷u振蕩，混勻，繼續(xù)在水浴中振蕩2 min，趁熱加入2 mL正己烷，充氮?dú)夥饪?，漩渦振蕩混勻，繼續(xù)在水浴中振蕩1 min，放置于室溫冷卻，加入少量飽和氯化鈉水溶液，邊加邊輕微振蕩，繼續(xù)加到接近管口，靜置大約15 min使之分層，小心吸取上清液直接用于氣相色譜測(cè)定。

1．4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

本研究采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、溶劑及KOH用量作為響應(yīng)面分析的4個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)催化反應(yīng)的溫度、時(shí)間、催化劑用量和溶劑用量做進(jìn)一步優(yōu)化，分別以X1、X2、X3和X4代表，每個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼(如表1所示)。

表1 堿性異構(gòu)共軛亞油酸因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2．1 紫外光譜分析跟蹤共軛化反應(yīng)效果

控制反應(yīng)溫度180℃、反應(yīng)時(shí)間3 h不變，逐步增加催化劑用量占籽油質(zhì)量從5%～25%進(jìn)行堿異構(gòu)化催化反應(yīng)，以正己烷為參比，不同催化劑用量處理下產(chǎn)物的正己烷溶液的紫外吸收光譜圖如圖1。

圖1表明原料在200 nm處有比較大的吸收峰，隨著催化劑用量的增加，原料峰逐漸減弱，而在231 nm處產(chǎn)物吸收峰不斷增強(qiáng)，該峰是共軛亞油酸的特征吸收峰。表明海篷子籽油中亞油酸共軛異構(gòu)化生成共軛亞油酸。

其次，要作一點(diǎn)具體的指導(dǎo)。如怎樣劃分文章層次？怎樣歸納中心思想？怎樣分析寫(xiě)作特點(diǎn)等，我均根據(jù)《魏書(shū)生文選》第一卷介紹給學(xué)生。另如質(zhì)疑，我既教他們?cè)鯓訌恼n文內(nèi)容、形式乃至字、詞、標(biāo)點(diǎn)等各角度設(shè)疑，又以往屆生設(shè)的佳題來(lái)引路，尤其鼓勵(lì)學(xué)生在無(wú)疑處設(shè)疑。即如字詞，雖似抄抄，但我強(qiáng)調(diào)：篩選的過(guò)程、篩選的好不好，也看得出你的語(yǔ)文水平、作業(yè)態(tài)度。初一新生有很強(qiáng)的表現(xiàn)欲，他們自會(huì)一絲不茍。

圖1 紫外光譜分析跟蹤共軛化反應(yīng)進(jìn)程

2．2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化海篷子籽油共軛化催化反應(yīng)工藝條件

2．2．1 反應(yīng)影響因素的選取以及分析方案

在綜合考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等單因素試驗(yàn)對(duì)共軛化催化反應(yīng)的影響后，根據(jù)相應(yīng)試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box－Behnken設(shè)計(jì)方案及海篷子籽油共軛化率的試驗(yàn)值

續(xù)表

2．2．2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用minitab13統(tǒng)計(jì)軟件，通過(guò)表2中海篷子籽油堿異構(gòu)化反應(yīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得海篷子籽油共軛化率對(duì)編碼自變量反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑用量和溶劑用量的二次多項(xiàng)回歸。

2．2．3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為:

式中:Y為共軛化率/%;X1為反應(yīng)溫度/℃;X2為反應(yīng)時(shí)間/h;X3為m(KOH):m(油);X4為m(溶劑):m(油)。

表3的方差分析表明，該回歸方程顯著(P=0．002)。R2=91．5%，表明響應(yīng)值共軛化率(Y)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預(yù)測(cè)響應(yīng)值海篷子籽油共軛化率(Y)的實(shí)際情況。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表4)可知，因素X1對(duì)共軛化率(Y)線性效應(yīng)高度顯著，因素X3對(duì)共軛化率(Y)線性效應(yīng)比較顯著，而因素X2、X4對(duì)共軛化率率(Y)線性效應(yīng)不顯著，因此影響籽油共軛化率的個(gè)因素主次排列依次是:溫度＞催油比＞反應(yīng)時(shí)間＞溶油比;因素X21、X22和 X24對(duì)海篷子籽油共軛化率(Y)曲面效應(yīng)不顯著;因素 X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4對(duì)共軛化率(Y)交互效應(yīng)不顯著，而 X1X4對(duì)共軛化率(Y)交互效應(yīng)較顯著，因此各具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 方差分析表

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

對(duì)擬合方程求偏導(dǎo)，可以得到模型的最大值，即當(dāng)反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1時(shí)，其理論共軛化率達(dá)到97．5%。

2．2．4 驗(yàn)證試驗(yàn)

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在上述優(yōu)化的催化反應(yīng)條件下(即當(dāng)反應(yīng)溫度為180 ℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油=2∶1時(shí))進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得結(jié)果如表5所示?；貧w方程所得的預(yù)測(cè)值97．5%與驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值94．6%的誤差為2．97%，在誤差允許范圍內(nèi)(20%)說(shuō)明回歸方程能較真實(shí)地反映各篩選因素對(duì)共軛化率的影響，證明應(yīng)用響應(yīng)面法在提高海篷子籽油共軛化率的回歸模型可靠。

2．3 海篷子籽油及其CLA產(chǎn)品的氣相色譜分析

將海篷子籽油及在反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1條件下所得的CLA產(chǎn)品甲酯化后，經(jīng)氣相色譜分析，海篷子籽油、亞油酸標(biāo)樣、CLA標(biāo)樣及制備的CLA產(chǎn)品的氣相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同種油的氣相色譜圖

由圖2可知，海篷子籽油中亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)73．52%，在最佳反應(yīng)條件即反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1條件下所得的CLA產(chǎn)品與標(biāo)樣比較可知，15．798 min和16．135 min的色譜峰是共軛亞油酸的活性成分(9c，11t－CLA;10t，12c－CLA)，活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)68%以上，亞油酸共軛化率達(dá)93．4%，同時(shí)海篷子共軛亞油酸氣相色譜中出現(xiàn)其他的色譜峰推測(cè)其為軟脂酸、硬脂酸以及油酸等。而比對(duì)圖2a、圖2c可知在13．775 min出現(xiàn)亞油酸色譜峰，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)73．52%。

2．4 共軛亞油酸的理化指標(biāo)分析

對(duì)共軛化催化反應(yīng)后所得的CLA產(chǎn)品進(jìn)行理化指標(biāo)的分析，各指標(biāo)均按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)分析。分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 CLA產(chǎn)品理化指標(biāo)分析結(jié)果

從表6可以看出，海篷子籽油CLA產(chǎn)品碘價(jià)、皂化價(jià)略低于共軛亞油酸酯產(chǎn)品項(xiàng)目指標(biāo)，而酸價(jià)略偏高，推斷可能是因?yàn)閴A催化反應(yīng)后所得產(chǎn)物油酯經(jīng)過(guò)酸解后，由于酸有殘留所致。

3 結(jié)論

利用Minitab13軟件，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)(Box－Behnken)方法對(duì)海篷子籽油共軛化催化反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，探討了各因素間的交互作用，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬和預(yù)測(cè)。本研究以乙二醇作為溶劑體系進(jìn)行海篷子籽油合成CLA的反應(yīng)，解決了很多研究以丙三醇為溶劑導(dǎo)致共軛化率低的問(wèn)題，推斷可能因?yàn)楸驾^為黏稠阻礙堿異構(gòu)催化反應(yīng)的順利進(jìn)行，影響異構(gòu)反應(yīng)中甘油酯的水解以及雙鍵的移動(dòng)。優(yōu)化后得到的最佳反應(yīng)條件即反應(yīng)溫度為180℃，反應(yīng)時(shí)間3．9 h，m(KOH):m(海篷子籽油)=0．254，m(乙二醇):m(海篷子籽油)=2∶1，該條件下共軛化率達(dá)到94．6%。

CLA產(chǎn)品經(jīng)氣相色譜分析所得色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對(duì)得到CLA產(chǎn)品在15．798 min和16．135 min的色譜峰是共軛亞油酸的活性成分(9c，11t－CLA，10t，12c－ CLA)，活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 68% 以上，共軛亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)87%以上。通過(guò)對(duì)CLA產(chǎn)品的理化指標(biāo)的分析，我們得到CLA產(chǎn)品的理化指標(biāo)接近食用共軛亞油酸酯的標(biāo)準(zhǔn)。因此該法所得產(chǎn)品安全，工藝可行。然產(chǎn)品在分離純化過(guò)程中經(jīng)酸化，水洗步驟伴有共軛亞油酸的損失。因此，為了提高CLA產(chǎn)品的得率，有必要對(duì)CLA的分離純化工藝做進(jìn)一步的優(yōu)化。

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Study on the Preparation of Conjugated Linoleic Acid with Salicornia herbacea Seed Oil and the Analysis of Composition

Pan Qunwen Chen Meizheng Wu Yan
(Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063)

Study the synthesis Tech－nology conditions of the Salicornia herbacea seed oil．Make the Salicornia herbacea seed oil as raw materials，KOH as catalyst，glycol as solvent，alkali isomerization method transformation of conjugated linoleic acid，using Box － Behnken experimental design，obtained the best preparation Tech－nology conditions Salicornia herbacea conjugate of seed oil the best preparation Tech－nology condition．Results show the Salicornia herbacea seed oil were good material on synthesis conjugated linoleic acids，the product of conjugated linoleic acid content over 87%with two kinds of activity isomers of conjugated linoleic acid content more than 68%．Optimal conditions were:temperature of 190℃，time of 3．9h，catalyst amount to oilas 25%and amount of solvent to oil in 2 times．The optimum conditions this research can make the conversion percent of the linoleic acid up to 94．6%．The physics＆ chemistry indexes of the CLA close to edible food standard and the process conditions are practical，is expected to develop into a kind of healthy cooking oil．

Salicornia herbacea，linoleic acid，conjugated linoleic acid，gas chromatograph，alkali isomerization

Q547

A

1003－0174(2012)02－0042－05

省部產(chǎn)學(xué)研合作專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010B090400461)

2011－05－03

潘群文，男，1985年出生，碩士，食品生物技術(shù)

陳美珍，女，1956年出生，教授，天然活性物質(zhì)研究與開(kāi)發(fā)