車前子中黃酮提取物對(duì)油脂的抗氧化活性研究

張俊生 陳莉華 段琛圭 侯孝璇 何 莉

車前子中黃酮提取物對(duì)油脂的抗氧化活性研究

張俊生 陳莉華 段琛圭 侯孝璇 何 莉

﹙吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，吉首 416000﹚

以車前子為原料超聲強(qiáng)化乙醇提取黃酮，通過單因素和正交試驗(yàn)獲得最佳工藝條件，研究了黃酮提取物對(duì)油脂的抗氧化性能及對(duì)羥基自由基的清除能力并與常用的抗氧化劑VC和檸檬酸比較。結(jié)果表明，在30%乙醇、料液比1∶40、超聲溫度60℃、超聲強(qiáng)化處理60 min的最佳工藝條件時(shí)，車前子中黃酮的提取率為2．8%，該提取物對(duì)羥基自由基的清除作用隨濃度增大而增強(qiáng)，對(duì)油脂有較強(qiáng)的抗氧化活性，抗氧化能力接近VC與檸檬酸，當(dāng)油脂在烘箱放置時(shí)間延長(zhǎng)使氧化程度加深時(shí)，黃酮對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)作用愈加顯著，所以車前子黃酮提取物更宜于作為動(dòng)物油的天然抗氧化劑添加于油脂及含油食品中。

車前子 黃酮 油脂 抗氧化活性

車前子(Semen Plantaginis)為車前科植物車前(Plantagoasiatica L．)或平車前(P．depressa Willd)的干燥成熟種子，是我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)用藥之一［1］。車前子性甘、微寒，歸肝、腎、肺、小經(jīng)。現(xiàn)代研究證明車前子具有致瀉、護(hù)肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等多項(xiàng)藥理作用［2］。

車前屬植物中含有芹菜素、槲皮素及野芩黃素及其苷等多種黃酮類化合物，是車前屬植物的主要有效成分之一［3－4］。黃酮類化合物除具有通常的抗菌、清熱解毒、抑制脂肪氧化酶等生物活性外，在油脂抗氧化方面有顯著效果，由于人工合成的抗氧化劑對(duì)人體有副作用，從植物中提取安全、天然的黃酮類物質(zhì)以取代人工合成抗氧化劑是油脂或含油食品添加劑的發(fā)展趨勢(shì)［5－6］。此前雖有關(guān)于大粒車前子黃酮類物質(zhì)提取分離［7－8］及對(duì)總黃酮的抗氧化性研究［9］的報(bào)道，但相比于其他黃酮類成分的研究，車前子中黃酮功能成分的提取分離及相關(guān)研究亟待加強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)車前子總黃酮提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為開發(fā)中藥天然抗氧化劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

車前子:吉首市武陵山大藥房，干燥粉碎，備用;蘆丁對(duì)照品:中國(guó)藥品生物制品鑒定所;動(dòng)物油:市售新鮮豬板油;植物油:金健牌茶籽油，市售;無水乙醇、丙酮、氯仿、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、水楊酸、FeSO4、30%H2O2、檸檬酸、VC、冰醋酸:均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JH 723可見分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司;UV－2450紫外可見分光光度計(jì):日本島津;Gzx－9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱:江蘇新億陽烘箱制造廠。

1．2 方法

1．2．1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁作為車前子黃酮提取物的對(duì)照品，按照NaNO2－Al(NO3)3－ NaOH 分光光度法［7］繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度A，以質(zhì)量濃度c(mg/mL)對(duì)吸光度(A)進(jìn)行線性回歸得回歸方程為:A=10．65c，R2=0．999 8。質(zhì)量濃度在0 ～0．05 mg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

1．2．2 車前子中黃酮類化合物的提取和測(cè)定

精確稱取車前子粉末0．200 0 g于錐形瓶中，在不同的條件下進(jìn)行超聲波提取，提取液經(jīng)離心過濾后，用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容至15 mL。準(zhǔn)確吸取2．0 mL提取液，按照1．2．1中方法依次加入各種試劑，再加水定容至25 mL，以空白作參比，在最大吸收峰波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A，由回歸曲線方程求出濃度，并計(jì)算提取液中黃酮的質(zhì)量。按照下列公式計(jì)算黃酮的提取率:

1．2．3 車前子黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除作用

參照Fenton反應(yīng)［10］建立羥基自由基生成模型，在15 mL比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 mL，6 mmol/L H2O23 mL，搖勻，接著加入8 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液。加入1 mL的蒸餾水，沒加粗提取物比色管所測(cè)的吸光度為，其余比色管根據(jù)試驗(yàn)條件加入不同濃度的提取物1 mL，在40℃水浴中放置15 min后取出，以蒸餾水為參比，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度。

式中:Ax為加入提取液后的吸光度，A0為空白對(duì)照的吸光度。

1．2．4 過氧化值的測(cè)定

在無水酸性條件下，油脂中的過氧化物使I－定量氧化成I2，I2與I－結(jié)合生成易溶于水的I－3，利用的顏色與標(biāo)準(zhǔn)碘液進(jìn)行比較定量。

按照文獻(xiàn)［11］的處理方法，在353 nm波長(zhǎng)下，I2含量(m/μg)對(duì)吸光度(A)的線性回歸方程為:A=0．004 35m －0．249 96，R2=0．987 5。

車前子黃酮對(duì)油脂的抗氧化性采用國(guó)際通用的烘箱強(qiáng)化貯存法:用適量濃度的黃酮提取液(用VC和檸檬酸為對(duì)照)加到溫?zé)嶝i油與植物油中，攪勻，在一定溫度的烘箱中強(qiáng)化保存，以不加任何抗氧化劑作對(duì)照組，于不同時(shí)間取樣測(cè)定油樣過氧化值。

在100 mL三角瓶中加入油∶黃酮溶液=5∶1(體積比)的油液溶液24 mL。在一定條件下反應(yīng)，間隔70 min精密稱取定量的油樣于干燥的25 mL比色管中，加入氯仿－冰醋酸溶液5 mL，混勻，加入碘化鉀飽和堿液0．2 mL，混勻，輕搖30 s，再置暗處3 min，然后加蒸餾水至刻度，加塞，顛倒混勻2～3次，靜置約5～10 min，待水相澄清后，取上清液于1 cm石英比色皿中，在353 nm處以空白作參比讀取各管的吸光值，由回歸方程得碘含量。

抗氧化劑對(duì)油脂的保護(hù)率:

式中:η為抗氧化劑對(duì)油脂的保護(hù)率;POV初為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)化氧化時(shí)的過氧化值;POV末1為添加抗氧化劑的油脂強(qiáng)化氧化后的過氧化值;POV末2為未添加抗氧化劑的油脂強(qiáng)化氧化后的過氧化值。

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素試驗(yàn)

以車前子總黃酮的提取率為指標(biāo)，在40 W超聲功率、13 kHz超聲頻率及250 W加熱功率的條件下，考察不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、溫度等因素對(duì)提取率的影響。

2．1．1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

在溫度為30℃、料液比為1∶30、超聲60 min時(shí)，考察不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)車前子黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖2可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大黃酮的提取率隨之增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)達(dá)到最大，此后提取率下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用40%乙醇作提取溶劑。

2．1．2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

以40%的乙醇為提取劑，控制溫度為30℃，料液比為 1∶30，分別超聲 10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖2可看出，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，車前子黃酮提取率40 min以前快速上升，40～50 min保持緩慢上升趨勢(shì)，50～70 min又增長(zhǎng)迅速，80 min后開始下降。有效成分濃度差是超聲提取的主要?jiǎng)恿?，在提取初期，有效成分濃度差大，因此提取速率快，提取率也增加明顯，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑中有效成分濃度逐漸增大，與固相中的濃度差逐漸變小，即推動(dòng)力變小，所以提取速率慢慢減慢，提取率增加不明顯，直至推動(dòng)力為零，有效成分不再溶解［8］。隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，超聲過程不斷產(chǎn)熱，對(duì)黃酮類化合物活性成分造成損失，從節(jié)約能源角度考慮，確定最佳工藝條件70 min為宜。

2．1．3 料液比對(duì)提取率的影響

以40%乙醇作溶劑，在溫度為 30℃、超聲70 min時(shí)，選擇不同的料液比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響

由圖3可以看出，隨著料液比的增加，黃酮提取率先增大，當(dāng)增大到1∶40時(shí)到達(dá)最大，隨后開始減小。因此選用1∶40的料液比進(jìn)行提取。

2．1．4 溫度對(duì)提取率的影響

以40%乙醇為溶劑，料液比為1∶40，在不同的溫度下超聲70 min，得到結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)提取率的影響

由圖4可得，隨著試驗(yàn)范圍內(nèi)溫度的升高，黃酮提取率總體呈上升趨勢(shì)。一般說來，溫度升高，溶劑的表面張力系數(shù)及黏滯系數(shù)下降，蒸氣壓升高，超聲空化閾值下降，有利于空化泡的產(chǎn)生，使提取率增大，但溫度過高，容易導(dǎo)致活性物質(zhì)失效。因此，選擇60℃為宜。

2．2 正交試驗(yàn)確定最佳條件

綜合前面所做的單因素試驗(yàn)，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度為主要影響因素，以黃酮提取率為判斷指標(biāo)，選用表1的L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

由表2中極差值R顯示，超聲提取各因素對(duì)車前子黃酮提取率影響的主次順序?yàn)?A＞D＞B＞C，即超聲溫度影響最大，其次為料液比。由此可確定最佳工藝條件為 A3B2C1D3，即在60℃溫度下，用30%乙醇以1∶40的料液比，超聲60 min進(jìn)行提取。

2．3 最佳工藝條件驗(yàn)證

采用正交試驗(yàn)中最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn):稱取車前子粉末1．00 g，加入40 mL 30%乙醇，在60℃下超聲60 min，離心過濾，測(cè)定吸光度計(jì)算提取率，做 3次平行試驗(yàn)，提取率分別為:2．782%、2．828%、2．843%。結(jié)果顯示，該工藝條件對(duì)結(jié)果有很好的穩(wěn)定性。與文獻(xiàn)［9］的工藝條件及得率(乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、固液比1∶30、90℃提取3次、每次2 h，總黃酮得率2．61%)比較，本試驗(yàn)由于采用了超聲波輔助提取，溶劑耗用量減少，時(shí)間縮短，整體條件溫和且得率提高。

2．4 車前子黃酮抗氧化性研究

2．4．1 車前子黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

在40℃下，用不同濃度的黃酮提取液清除羥自由基，結(jié)果見圖5。

圖5 黃酮濃度對(duì)羥自由基清除率的影響

由圖5可見，車前子提取物總黃酮在低濃度時(shí)對(duì)羥自由基的清除作用不明顯，清除率僅為8% ～9%，而當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到0．2 mg/mL以后，清除率可達(dá)到12．5%以上，表明總黃酮提取物對(duì)羥自由基有清除作用。

2．4．2 車前子黃酮對(duì)油脂的抗氧化性

VC和檸檬酸常作為加入到食品中的抗氧化劑，試驗(yàn)以此為對(duì)照，在40℃條件下，比較了0．50 mg/mL車前子黃酮、0．50 mg/mL VC、0．50 mg/mL 檸檬酸溶液在不同時(shí)間段對(duì)植物油(圖6)及動(dòng)物油(圖7)的抗氧化性。

圖6 不同抗氧化劑對(duì)動(dòng)物油抗氧化性的影響

由圖6的結(jié)果表明，隨著油脂在烘箱放置時(shí)間延長(zhǎng)，空白動(dòng)物油的過氧化值(POV)快速上升，表明油脂自氧化反應(yīng)程度加大;添加黃酮提取液后，動(dòng)物油的過氧化值均有不同程度的降低，這表明提取液能增加動(dòng)物油的抗氧化能力;烘箱放置時(shí)間在200 min前，檸檬酸、VC、黃酮提取液的抗氧化能力并不顯著，POV值降低不多，但當(dāng)烘箱放置時(shí)間超過250 min后，檸檬酸、VC、黃酮提取液的抗氧化能力顯著增強(qiáng)，空白動(dòng)物油與添加抗氧化劑的溶液的的過氧化值差距明顯拉大;而黃酮提取液與常用的抗氧化劑檸檬酸、VC的抗氧化性沒有太大差別。

圖7 不同抗氧化劑對(duì)植物油抗氧化性的影響

圖8 不同溫度下黃酮提取物對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)率

圖7 的結(jié)果表明，隨著在烘箱放置時(shí)間延長(zhǎng)，空白植物油的過氧化值快速上升，表明油脂自氧化反應(yīng)程度加大;添加黃酮提取液后，植物油的過氧化值均有不同程度的降低，這表明提取液能增加植物油的抗氧化能力;車前子黃酮、檸檬酸、VC均能使植物油的POV值降低，但其降低效果不及動(dòng)物油，這是因?yàn)槟承┲参镉椭泻芯S生素E、酚類化合物等［12］，這些物質(zhì)也具有抗氧化作用，所以難以形成像動(dòng)物油那樣明顯的對(duì)比;雖然不同的抗氧化劑對(duì)植物油的抗氧化能力不同，但車前子黃酮、檸檬酸、VC 3種抗氧化劑對(duì)植物油的抗氧化能力均非常接近。

2．4．3 溫度對(duì)黃酮提取物抗油脂氧化效果的影響

在相同溫度下，在烘箱強(qiáng)化保存時(shí)間的長(zhǎng)短將使油脂的過氧化值有相當(dāng)大的區(qū)別，同樣，在相同的強(qiáng)化保存時(shí)間段，烘箱設(shè)置溫度的高低也對(duì)油脂過氧化值有影響。由此研究了在0．50 mg/mL車前子黃酮、0．50 mg/mL VC、0．50 mg/mL檸檬酸溶液條件下，溫度對(duì)黃酮抗油脂氧化效果的影響，結(jié)果如圖8、圖9。

由圖8可知，在烘箱溫度為40、50、和60℃時(shí)，黃酮提取物對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)率都呈先抑后揚(yáng)趨勢(shì)，隨樣品在烘箱放置時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)作用愈加顯著，當(dāng)放置時(shí)間為300 min時(shí)，黃酮提取物對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)率可達(dá)到50%以上，表明了黃酮提取物優(yōu)越的抗氧化性能。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，同一時(shí)間段，車前子黃酮提取物對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)率隨溫度的升高而降低，可能是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)的活性隨著溫度的升高，而逐漸降低。

圖9 不同溫度下黃酮提取物對(duì)植物油的保護(hù)率

由圖9可知，與對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)情況不同，隨著溫度的上升，黃酮提取物對(duì)植物油的保護(hù)率逐漸降低，說明車前子黃酮提取物更宜于作為動(dòng)物油的抗氧化劑，在溫和的環(huán)境中，升溫會(huì)降低其活性。在40℃和50℃時(shí)，黃酮對(duì)植物油的保護(hù)率變化趨勢(shì)大體相同，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，保護(hù)率逐步降低。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，車前子在60℃下，選擇30%乙醇為提取劑，料液比為 1∶40(g∶mL)，超聲 60 min，提取率達(dá)到2．8%。該提取物對(duì)羥基自由基的清除作用隨濃度增大而增強(qiáng)，對(duì)油脂有較強(qiáng)的抗氧化活性，抗氧化能力接近VC與檸檬酸，作為天然抗氧化劑可取代后者添加于油脂及含油食品中。

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Study on Grease Antioxidation of Flavone from Semen Plantaginis

Zhang Junsheng Chen Lihua Duan Chengui Hou Xiaoxuan He Li
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000)

Flavone was extracted by ultrasonic－assisted ethanol from semen plantaginis．The influence factors were studied based on single factor and orthogonal test．The research on flavone＇s scavenging effect to hydroxyl free radical(·OH)and antioxidation to oil and fat of was carried out，and the result was compared with that of the other antioxidants such as VC and citric acid．The results showed that the extraction rate of flavone from semen plantaginis was 2．8%when the optimal technological conditions was 30%of ethanol，1∶40(g∶mL)of material－ to － liquid ratio and 60 min ultrasonic extracting time at 60℃ ultrasonic temperature．The scavenging capability on·OH free radical increased as flavone concentration increases．The flavone extract exhibited good antioxidant effects to fat and oil same as VC and citric acid．On condition that fat and oil were kept in oven for a longer time and consequently oxidation aggravation occurs，the antioxidative effect of the flavonoid extract on grease will become more apparent．So the flavonoid extract from semen plantaginis is more suitable to be a natural antioxidative additive for oil and grease．

semen plantaginis，flavone，fat and oil，antioxidation

S667．4

A

1003－0174(2012)02－0062－06

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金(10C262143 02421)，科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金(11C26214305373)

2011－04－10

張俊生，女，1986年出生，碩士，應(yīng)用化學(xué)

陳莉華，女，1961年出生，博士，教授，應(yīng)用化學(xué)