蜜蜂中腸一株耐氯霉素細(xì)菌的篩選與鑒定

陳大福 陳梅強(qiáng) 李江紅 梁 勤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂的腸道內(nèi)棲息著相當(dāng)數(shù)量的微生物類群。這些微生物對(duì)于蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)和代謝起著重要的作用。根據(jù)微生物與蜜蜂的關(guān)系可將其大致分為兩類：病原微生物和共生菌。蜜蜂腸道內(nèi)存在一定量的病原微生物，其中細(xì)菌性病原菌主要包括擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜂房球菌、尤瑞狄斯桿菌、糞鏈球菌、蜂房芽孢桿菌、敗血病桿菌、塵埃芽孢桿菌等。其中對(duì)于引起美洲幼蟲(chóng)腐臭病的擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌和引起歐洲幼蟲(chóng)腐臭病的蜂房球菌的研究報(bào)道最多。2006年，戎映君等分離了一種新的蜜蜂細(xì)菌性幼蟲(chóng)病病原菌，經(jīng)分離鑒定此致病菌為腸球菌屬的屎腸球菌[1]。蜜蜂與微生物的共生是一種普遍存在的現(xiàn)象，許多共生菌對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)、發(fā)育起著重要作用。蜜蜂與其他昆蟲(chóng)抵御疾病可能是通過(guò)與其共生的微生物的屏蔽效應(yīng)。Evans & Armstrong的研究表明，某些共生菌對(duì)蜜蜂主要病原細(xì)菌擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌具有抑制效應(yīng)，并且共生菌可能對(duì)普遍的病原體有自然的拮抗作用[2]。

細(xì)菌的16S rRNA因其編碼基因集“保守、變異”于一身，作為生物系統(tǒng)指標(biāo)最為合適[3]。不同種細(xì)菌基因序列的比較研究表明，16S rRNA基因在同種細(xì)菌間高度保守，因此，在細(xì)菌“種”水平的鑒定上，16S rRNA基因的全序列分析可作為“金標(biāo)準(zhǔn)”[4，5]。16S rRNA基因保守性又是相對(duì)的，在保守區(qū)間存在著9或10個(gè)變異區(qū)，不同細(xì)菌屬、種間有不同程度的差異。因此，可利用保守區(qū)序列設(shè)計(jì)細(xì)菌通用引物將細(xì)菌16S rRNA片斷擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定[6]。

本研究通過(guò)用含氯霉素的LB培養(yǎng)基篩選和分離蜜蜂中腸中的細(xì)菌，并運(yùn)用PCR的方法體外擴(kuò)增并克隆該細(xì)菌的16S核糖體RNA基因的片段序列，通過(guò)比對(duì)序列對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）采自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)；菌株是從意大利蜜蜂成年工蜂中腸中篩選分離培養(yǎng)所得。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂中腸細(xì)菌的篩選分離

制作若干含終濃度為20 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基，取成年蜜蜂中腸的內(nèi)容物，搗碎加適當(dāng)?shù)臏缇♂寯噭?，均勻涂布在培養(yǎng)基上，挑取菌斑，提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.2 細(xì)菌的裂解

用滅菌移液槍的槍頭挑取單個(gè)菌斑，加入到含有200 μl細(xì)菌裂解液和1 μl蛋白酶K的離心管中，用震蕩器將之混勻，置PCR儀中裂解反應(yīng)。反應(yīng)程序：65 ℃溫育30 min，98 ℃裂解20 min，裂解反應(yīng)結(jié)束后12000 rpm離心5 min取上清液6μl做PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank中檢索出多種細(xì)菌的16 S rRNA基因序列，通過(guò)Blast軟件在線進(jìn)行同源性比較，在16S rRNA基因序列的保守序列區(qū)間設(shè)計(jì)通用引物。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.4 細(xì)菌16s rRNA基因片段的克隆

1.2.4.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

（1）反應(yīng)體系：模板DNA（細(xì)菌裂解液）6 μl，10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs 4 μl，引物F、R各2 μl，Taq酶2μl，補(bǔ)ddH2O至50 μl。

（2）反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性45 s、52 ℃退火合成105 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

1.2.4.216s rRNA基因片段的克隆與測(cè)序

本研究采用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法，用DNA快速純化回收試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）純化回收PCR產(chǎn)物。利用pGEM-T Easy Vector SystemⅠ試劑盒（Promega）進(jìn)行載體連接與轉(zhuǎn)化，用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校ū本┒?guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定。一般反應(yīng)體系為：EcoRⅠ1 μl，10×Buffer 2 μl，質(zhì)粒DNA 3 μl（≤1 μg），滅菌水補(bǔ)至20 μl。37℃溫浴反應(yīng)2～3 h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，能切出相應(yīng)片段的即為陽(yáng)性。將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液，委托生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用Primer-BLAST軟件在線與細(xì)菌的16S rRNA基因片段序列進(jìn)行多重比對(duì)分析各序列的保守區(qū)和變異區(qū)，設(shè)計(jì)并合成細(xì)菌16S rRNA基因片段序列的通用引物：

F：5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'R：5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

2.2 細(xì)菌16s rRNA基因片段序列的克隆

2.2.1 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物回收

用設(shè)計(jì)的通用引物分別對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用DNA快速純化/回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，溶解于20μl的TE溶液中。取5μl回收的產(chǎn)物經(jīng)1.5 %（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)到1500bp左右的單一條帶非常清晰，說(shuō)明回收得率較高（圖1）。

2.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒DNA和原空載體質(zhì)粒DNA分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。空載體質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切后，僅產(chǎn)生2000bp以上的單一條帶。而重組質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物中產(chǎn)生大小為750bp左右2個(gè)片段，該2個(gè)片段大小之和與1500bp左右的PCR產(chǎn)物基本相等（圖2），酶切產(chǎn)生2個(gè)片段可能是PCR產(chǎn)物片段內(nèi)部還有一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)。因此，該重組質(zhì)粒即可鑒定為陽(yáng)性克隆。

圖1 細(xì)菌DNA的PCR產(chǎn)物純化回收凝膠電泳圖譜

2.3 16S rRNA基因片段的序列分析

將鑒定為陽(yáng)性的克隆C3委托上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明所克隆的16S rRNA基因片段為1506 bp的DNA片斷（圖3）。使用RESEARCH軟件查找結(jié)果如預(yù)計(jì)一樣在第666位有一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，經(jīng)EcoRI酶切為665bp和835bp的2個(gè)片段。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖3 細(xì)菌16S rRNA基因片段序列

2.4 耐氯霉素細(xì)菌菌株的鑒定

將所測(cè)得序列與NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank收錄細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果可以搜索到大量細(xì)菌的16S rRNA基因片段序列與所測(cè)得細(xì)菌的序列有較高的相似度（圖4）。該序列與GQ259887序列吻合度100 %，證明該序列為克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的特有序列，說(shuō)明從蜜蜂中腸中培養(yǎng)分離出的耐氯霉素細(xì)菌菌株為克雷伯氏菌。

圖4 所測(cè)細(xì)菌的16S rRNA基因片段序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

4 討論

（1）細(xì)菌16S rRNA鑒定方法作為分子生物學(xué)快速發(fā)展的產(chǎn)物，與傳統(tǒng)的診斷方法相比，準(zhǔn)確性和靈敏度均有了較大的提高。由于l6S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性，序列分析的重現(xiàn)性極高，基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進(jìn)，應(yīng)用16S rRNA作為分子指標(biāo)，可以實(shí)現(xiàn)快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。

（2）本研究從蜜蜂中腸分離出的耐氯霉素菌株經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌?？死撞暇鸀槟c桿菌科中一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，對(duì)外界抵抗力強(qiáng)對(duì)多數(shù)抗生素易產(chǎn)生耐藥性。與腸桿菌科其他細(xì)菌一樣，具菌體抗原和莢膜抗原?？死撞暇鷱V泛存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道以及水、土壤和谷物中[7]。Singh等[8]于1992年在魚(yú)、蝦、蟹等水產(chǎn)類食品中檢測(cè)到肺炎克雷伯菌，但未對(duì)其致病性展開(kāi)研究。還有一些學(xué)者先后在患病石龜、中華鱉（Trionyx sinensis）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）中分離到該菌[9，10]；在蜜蜂體內(nèi)尚屬首次發(fā)現(xiàn)該菌。一般情況下克雷伯氏菌不致病，因?yàn)樗且环N條件致病菌，對(duì)畜禽危害不大，發(fā)病與寄主防御功能缺陷及誘發(fā)因素有關(guān)。目前尚未發(fā)現(xiàn)有克雷伯氏菌引起的蜜蜂疾病，但不排除有和其他細(xì)菌共同作用引起蜜蜂疾病的可能性。

（3）本研究結(jié)果證明在蜜蜂腸道中存在某些耐藥性的菌株。這一現(xiàn)象很可能是在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過(guò)程中給蜂群防病、治病而長(zhǎng)期、頻繁使用抗生素造成的。蜂群用藥過(guò)程中所使用的抗生素對(duì)蜜蜂腸道細(xì)菌，無(wú)論是共生菌還是病原菌均產(chǎn)生影響，長(zhǎng)此以往，蜜蜂腸道細(xì)菌都會(huì)對(duì)所使用的抗生素產(chǎn)生一定程度的耐藥性。因此，在蜂群中不科學(xué)使用抗生素，不僅會(huì)使蜜蜂病原菌產(chǎn)生耐藥性，影響防治效果，還會(huì)對(duì)蜂產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。這就要求在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過(guò)程中謹(jǐn)慎用藥，避免大劑量使用，長(zhǎng)期使用，以延緩病原菌耐藥性的產(chǎn)生。

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