肝脾調補方對小鼠免疫性肝損傷的防護作用*

阮連國 張 妍 朱清靜△

1.武漢市醫(yī)療救治中心肝病科 (湖北武漢，430023) 2.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心

肝脾調補方是我院肝病科治療病毒性肝炎的院內制劑，臨床已應用多年，其在改善患者肝功能和臨床癥狀方面療效確切。由黨參、白芍、郁金、甘草、當歸、茯苓、半夏、白術、柴胡、陳皮、雞內金等組成?，F代研究表明免疫損害機制在病毒性肝炎發(fā)病和慢性化過程中起到主要作用。我們通過動物實驗觀察了肝脾調補方對小鼠免疫性肝損傷的防護作用，并初步探討其作用機制，為其臨床應用提供理論依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18g～22g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物試驗中心提供。

1.2 藥物及試劑 肝脾調補方由黨參、白芍、郁金、甘草、當歸、茯苓、半夏、白術、柴胡、陳皮、雞內金等組成，由我院中藥制劑室提供，加10倍量水浸泡4小時，加熱煎煮1小時，過濾，藥渣再加8倍水，煎煮1小時過濾，兩次濾液合并，濃縮制成濃度為1∶1(即1ml水煎劑含1g生藥)的水煎劑備用?？ń槊?BCG)由上海生物制品研究所提供。脂多糖 (LPS)由美國 Sigma公司提供。ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px試劑盒:南京建成生物工程研究所;TNF-α酶聯免疫試劑盒:由上海森雄科技實業(yè)有限公司提供，編號WZ201010;EILSA試試劑盒由武漢博士德生物公司提供;TBA240FR型全自動生化分析儀:日本東芝公司生產。

1.3 動物與分組 動物隨機分為5組，即正常對照組，模型對照組，肝脾調補方高、中、低劑量組 (28、14、7g/kg)，每組12只。

1.4 造模 正常組尾靜脈注射生理鹽水 (0.2ml/只)，其余各組每只小鼠尾靜脈注射1%BCG溶液0.2ml。次日起，正常組和模型組每日灌胃生理鹽水30ml/kg，連續(xù)12天;肝脾調補方低、中、高劑量分別給予0.5、1.0、2.0g/kg劑量的藥物。連續(xù)給藥12天，末次給藥后，正常組尾靜脈注射生理鹽水 (0.2ml/只)，其余各組動物均尾靜脈注射LPS(4g/只)，靜脈注射后禁食16小時，小鼠摘眼球取血，分離血清，以試劑盒所示方法測定血清中ALT、AST和TNF-α含量。然后處死小鼠，取肝臟，用生理鹽水配10% 肝組織，用超聲波細胞粉碎機勻漿，低溫離心，按試劑盒說明書所述方法用Agilent8453紫外可見分光光度計測定肝勻漿中 SOD、MDA、GSH-Px的含量。

2 結果

2.1 對血清ALT、AST含量的影響 見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST的影響()

表1 各組小鼠血清ALT、AST的影響()

與正常組比較，☆P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.01，#P＞0.05

表1顯示，與正常組相比較，模型組血清ALT、AST水平升高，P＜0.01，說明模型建立成功。與模型組比較，肝脾調補方高、中劑量組均能非常顯著地降低小鼠血清中升高的ALT、AST水平 (P＜0.01)，低劑量組則顯示無效;肝脾調補方中、高劑量組之間降低ALT水平的作用存在量效關系。

2.2 對免疫性肝損傷小鼠肝TNF-α含量的影響 見表2。

表2顯示，與正常組相比較，模型組TNF-α水平升高，P＜0.01;與模型組比較，肝脾調補方高、中劑量組均能非常顯著地降低小鼠TNF-α水平 (P＜0.01)，低劑量組則顯示無效;肝脾調補方中、高劑量組之間降低TNF-α水平的作用存在量效關系。

2.3 對肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px水平的影響 見表3。

表2 肝脾調補方對免疫性肝損傷小鼠TNF-α含量影響()

表2 肝脾調補方對免疫性肝損傷小鼠TNF-α含量影響()

與正常組比較，☆P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.01，#P＞0.05

表3 肝脾調補方對免疫性肝損傷小鼠SOD、MDA、GSH-Px水平影響()

與正常組比較，☆P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

表3顯示，與正常組比較，模型組、肝脾調補方高、中、低劑量組肝勻漿SOD、GSH-PX水平顯著降低 (P＜0.01)，MDA水平顯著增高 (P＜0.01)。肝脾調補方高、中、低劑量組均能升高模型小鼠肝勻漿 SOD、GSH-Px的水平 (P＜0.01)，降低MDA的水平 (P＜0.01)。肝脾調補方高、中、低劑量組在升高小鼠肝勻漿SOD、GSH-Px水平及降低MDA方面呈一定的量效關系 (P＜0.05)。

3 討論

免疫性肝損傷 (Immunological Liver Injury，ILI)通常由生物性因素等引起，常見的原因為病毒感染，如乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)等病毒的感染。有研究表明，免疫性肝損傷動物模型的病理改變及肝細胞損傷機制均與病毒性肝炎相類似［1～5］。近年來的研究表明，自由基引起的生物膜脂質過氧化反應，在肝損傷與肝纖維化的發(fā)病機制中起著非常重要的作用。SOD作為清除自由基的重要酶類之一，其活力的高低間接反應了機體清除自由基的能力;而MDA作為自由基作用于脂質發(fā)生過氧化反應的終產物，可反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映細胞損傷的程度［6，7］。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解的酶，一般認為它在細胞內能清除有害的過氧化物代謝產物，阻斷脂質過氧化鏈鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞分泌的具有多種生物活性的多肽調節(jié)因子，TNF-α既能直接損傷肝細胞，又能參與肝臟炎癥、肝細胞再生等病理生理過程［8］。

中醫(yī)學認為免疫性肝損傷是在人體正氣不足基礎上，濕熱疫毒侵于血分所致。其病因為機體稟賦薄弱、素體虧虛、正氣不足，外感濕熱疫毒之邪。其發(fā)病機理是由于“濕熱疫毒”乘機體正虛而入，蘊伏于肝，損傷肝脾，繼而及腎。其病位在肝，涉及脾、腎、胃、膽等臟器［9～11］。肝脾調補方由黨參、白芍、郁金、甘草、當歸、茯苓、半夏、白術、柴胡、陳皮、雞內金等藥物組成，具有疏肝理氣健脾的作用。臨床研究證實其有改善患者臨床癥狀、降低ALT、AST和總膽紅素、促進HBV DNA轉陰的作用［12］，能阻止膠原肝內沉積，抑制肝纖維化，減輕肝臟炎癥，促進肝細胞功能恢復，從而降低肝纖維化指標［13］。

本實驗觀察結果表明，肝脾調補方可明顯降低免疫性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TNF-α水平;減少肝組織勻漿的MDA含量，升高肝勻漿SOD、GSH-Px含量。表明肝脾調補方通過提高SOD的活力，加速MDA的清除，從而抑制機體的脂質過氧化反應，提高機體對自由基的清除能力，減少炎性細胞因子的產生，達到減輕肝細胞損傷作用。

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