補(bǔ)腎清毒法對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響*

彭皓均 沈 強(qiáng)△ 劉亞敏 徐秋英 吳 彥 王 丹

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院四內(nèi)科 (廣東廣州，510405) 2.暨南大學(xué)附屬黃埔中醫(yī)院3.安徽省太湖縣人民醫(yī)院

我國(guó)屬乙型肝炎高流行地區(qū)。一般人群的HBsAg陽(yáng)性率為9.09%［1］。目前認(rèn)為，CHB患者體內(nèi)DC功能受損，可能導(dǎo)致HBV感染慢性化［2，3］。我們依據(jù)多年治療經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為從“伏邪溫病”的理論解釋CHB的發(fā)病和癥狀更為合理［4］，并發(fā)現(xiàn)“補(bǔ)腎清毒法”具有明顯修復(fù)肝功能的作用［5］。因此，我們繼續(xù)運(yùn)用“補(bǔ)腎清毒法”治療CHB并觀察治療前后外周血樹突狀細(xì)胞表型和功能的變化情況，探討其改善CHB患者免疫功能的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年4月-2009年12月期間廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診的CHB患者49例，其中男37例，女12例，平均年齡25.86歲。病例均經(jīng)ELISA檢測(cè)HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc，PCR法檢測(cè) HBV DNA。其診斷符合2005年12月制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［6］。納入標(biāo)準(zhǔn):HBsAg和HBeAg持續(xù)陽(yáng)性半年以上;HBV DNA陽(yáng)性 (斑點(diǎn)雜交法)，HBV DNA載量 ＞105copies/ml;血清ALT持續(xù)波動(dòng)于正常上限2～5倍達(dá)6個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn):丙型肝炎、丁型肝炎、艾滋病、失代償性肝病;產(chǎn)婦或哺乳期婦女;半年內(nèi)曾使用過抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑者。

將49例患者隨機(jī)分為兩組，其中補(bǔ)腎清毒法治療組28例，核苷類似物治療組21例，兩組患者在年齡、病程、ALT、HBV DNA方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。見表l。另取10例健康人作為正常對(duì)照組。

表1 兩組患者臨床資料比較()

表1 兩組患者臨床資料比較()

1.2 試劑和儀器 淋巴分離液 (Ficoll，1.077 g/mL)購(gòu)自Axis-shield公司;RPMI-1640培養(yǎng)液、DPBS購(gòu)自 GIBCO公司;胎牛血清 (FBS)購(gòu)自PAA公司;牛血清白蛋白5g(BSA)購(gòu)自Roche公司;重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF 1×107μ/mg)、重組人白細(xì)胞介素4(rhIL-45×106μ/mg)、重組人腫瘤壞死因子-α (rhTNF-α 2 ×107μ/mg)、重組人腫瘤壞死因子-α (rhTNF-α 2×107μ/mg)均購(gòu)自Peprotech公司;異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗人CD80、CD83、HLADR單克隆抗體與藻紅蛋白標(biāo)記抗人CD86單克隆抗體購(gòu)自Biolegend公司;異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗人HLA-A2單克隆抗體購(gòu)自Cyclex公司;二甲基亞砜 (DMSO)購(gòu)自Sigma公司;絲裂霉素C(MMC 2mg)購(gòu)自Roche公司。Beckman Coulter流式細(xì)胞儀為ALTRA公司產(chǎn)品。顯微照相系統(tǒng)IX70為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 治 療方法 補(bǔ)腎清毒法組:桑寄生、旱蓮草、小葉鳳尾草、丹參、茵陳各20g，杜仲、山梔子各15g，葉下珠30g，甘草5g。1劑/d，水煎為250ml，溫服。核苷類似物組:拉米夫定 (葛蘭素史克)100mg/次，口服，1次/d。兩組療程均為24周。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)的分離 使用肝素抗凝管收集CHB患者及健康人外周血30ml，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，按細(xì)胞數(shù) (2～6)×106/孔接種到6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)體積3ml。在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育2小時(shí)，去除未貼壁細(xì)胞，獲得貼壁的PBMC。

1.3.3 凍存自體PBLs 將上述未貼壁細(xì)胞離心，加入配好的凍存液，置于4℃冰箱1小時(shí)，-20℃冰箱2小時(shí)，-80℃冰箱過夜，第2天轉(zhuǎn)液氮保存。

1.3.4 DC體外定向誘導(dǎo)分化和培養(yǎng) 按照Roman等［5］分離培養(yǎng)DC的方法稍作修改。貼壁單核細(xì)胞，每孔3ml加入完全培養(yǎng)基RPMI-1640(含10%胎牛血清)，按rhGM-CSF 100ng/ml和rhIL-4500U/ml的終濃度加入細(xì)胞因子。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。第3天、第7天半量換液1次 (含細(xì)胞因子rhGM-CSF 100ng/ml和rhIL-4500U/ml)。第9天每孔再添加各 10μl rhTNF-α (10ng/mL)及 rhIL-1β (10ng/ml)，共培養(yǎng)11天，于第11天收集DC。

1.3.5 倒置顯微鏡觀察 在每次換液時(shí)，用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)孔中的DC細(xì)胞形態(tài)特征變化，并攝像記錄。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子的表達(dá) 收集培養(yǎng)至11天的DC，洗滌后計(jì)數(shù)配成2×105個(gè)細(xì)胞/ml加入流式標(biāo)記管，分別向?qū)?yīng)管加入 FITC-CD80、CD83、HLA-DR、PECD86各5μl。陰性對(duì)照設(shè)一管，同型對(duì)照加入isotype antibody，4℃孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述DC表面分子。

1.3.7 自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) (AMLR) 收集培養(yǎng)11天的DC，用25μg/ml的絲裂霉素C于37℃處置45分鐘后，PBS洗滌3次，懸浮于完全RPMI1640培養(yǎng)基中，使DC的數(shù)量為1×104個(gè)細(xì)胞/孔加入96孔圓底培養(yǎng)板。用正常人DC作對(duì)照組，每組各3個(gè)復(fù)孔。每孔按照DC與淋巴細(xì)胞數(shù)量為1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例再加入復(fù)蘇后的自體T淋巴細(xì)胞，終體積200μl/孔，并繼續(xù)在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結(jié)束后，沉淀細(xì)胞吸出上清液，-20℃保存?zhèn)錂z。加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃孵育4小時(shí)后，吸出液體 (剩余少許在孔內(nèi))，加入DMSO 100μl/孔，1小時(shí)后用酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。刺激指數(shù) (SI)=試驗(yàn)孔OD值/空白孔OD值。

1.3.8 AMLR上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平 分別收集純的DC培養(yǎng)上清液和AMLR上清液，-20℃保存?zhèn)錂z。ELISA法檢測(cè)的細(xì)胞因子包括IL-10和IL-12，按照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)，用SPSS 13.0版軟件系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下DC的形態(tài)特征和DC的增殖 PBMC培養(yǎng)2小時(shí)后見圓形扁平貼壁細(xì)胞;培養(yǎng)24小時(shí)后可見貼壁單核細(xì)胞均勻地分布成細(xì)胞聚體，粘附于培養(yǎng)板底，尤以邊緣為著;加入細(xì)胞因子 (GM-CSF、IL-4)培養(yǎng)3～4天可見部分細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形狀，第7天加入TNF-α后，細(xì)胞成簇現(xiàn)象增多，可以見到形狀不規(guī)則、帶有毛刺狀突起的懸浮細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成簇的細(xì)胞團(tuán)散開，在培養(yǎng)10～11天時(shí)即可以看到細(xì)胞表面有明顯的毛刺狀突起，即為具有典型DC形態(tài)的懸浮細(xì)胞。兩組DC的體外增殖情況見圖1。

圖1 CHB患者組和對(duì)照組DC的體外增殖情況

2.2 治療前后DC的細(xì)胞表型鑒定分析 培養(yǎng)11天的DC，直接用FITC標(biāo)記的抗人MHC-II類抗原 (HLA-DR)、CD80、CD83和PE標(biāo)記的抗人CD86單克隆抗體分別標(biāo)記。用流式細(xì)胞儀分析顯示:CHB患者HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)率普遍降低，其DC表達(dá)共刺激分子的水平明顯低于正常人群 (P＜0.05)。治療 24周后，兩治療組 HLA-DR、CD80、CD83、CD86表達(dá)率均較治療前提高 (P＜0.05);補(bǔ)腎清毒法組HLA-DR、CD80、CD86表達(dá)率高于核苷類似物組(P＜0.05);CD83比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后與對(duì)照組DC表型表達(dá)比較 (，%)

表2 兩組患者治療前后與對(duì)照組DC表型表達(dá)比較 (，%)

2.3 DC刺激同種AMLR中T淋巴細(xì)胞增殖 采用自體淋巴細(xì)胞用于自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，健康人與CHB患者各5例，DC與自體淋巴細(xì)胞按照1∶100、1∶40、1∶10、1∶5的比例混合培養(yǎng)，其刺激指數(shù) (SI)分別為 (1.60±0.13)VS(1.23±0.05)、(2.20±0.14)VS(1.67±0.03)、 (1.46±0.15)VS(0.52±0.09)、(1.67±0.08)VS(0.62±0.15)。CHB患者DC刺激T細(xì)胞增殖的能力在各培養(yǎng)比例中均低于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且發(fā)現(xiàn)在1∶40的混合比例下，健康人和CHB患者的刺激指數(shù)均達(dá)到最高值，與本組其他混合比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。所以我們按照DC/T為1:40的比例進(jìn)行余下實(shí)驗(yàn)。CHB患者經(jīng)過24周的治療，補(bǔ)腎清毒法組的刺激指數(shù)為1.277±0.17，核苷類似物組刺激指數(shù)為1.786±0.21，經(jīng)治療后兩治療組的刺激指數(shù)仍低于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見圖2。

圖2 DC/T為1∶40時(shí)健康人、CHB患者治療前、接受不同方法治療后T淋巴細(xì)胞增殖比較

2.4 IL-10和IL-12的水平 AMLR上清液中健康人組IL-12水平高于CHB患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而IL-10比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，見表3。接受治療前，兩組患者IL-12比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。治療12周后，核苷類似物組IL-12高于補(bǔ)腎清毒法組 (P＜0.05)。治療24周后，兩組分別與治療前比較，IL-12有明顯升高，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。而兩組組間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表3 健康人與CHB患者治療前AMLR上清液IL-12比較(，ng/ml)

表3 健康人與CHB患者治療前AMLR上清液IL-12比較(，ng/ml)

表4 兩組患者治療前后AMLR上清液IL-12、IL-10比較(，ng/ml)

表4 兩組患者治療前后AMLR上清液IL-12、IL-10比較(，ng/ml)

3 討論

“伏邪溫病”則是指某些具有邪氣伏藏，逾時(shí)而發(fā)，發(fā)時(shí)即表現(xiàn)為里熱癥狀的溫病。HBV具有垂直傳染的特征，在圍生 (產(chǎn))期和嬰幼兒時(shí)期感染HBV者中，分別有90%和25%～30%將發(fā)展成慢性感染，此當(dāng)為先天腎虛不足所致。HBV感染慢性化過程與清代溫病醫(yī)家柳寶詒的“腎虛邪伏”學(xué)說所描述的相一致:即邪盛侵入機(jī)體，是因腎虛，邪伏于至虛之處，暗耗正氣所致。而伏邪發(fā)病，往往是人體正氣充盈鼓蕩，或時(shí)氣的引發(fā)。中醫(yī)又有“肝腎同源”的理論，因此我們提出CHB發(fā)病機(jī)理為“腎虛疫毒內(nèi)伏肝血”，故當(dāng)采用補(bǔ)腎清毒的治療方法。

DC是至今發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，也是惟一能激活純真T淋巴細(xì)胞 (naive T cells)的抗原遞呈細(xì)胞［8］，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在特異細(xì)胞免疫中起十分重要的作用。有研究表明，CHB患者體內(nèi)DC功能受損，可能導(dǎo)致HBV感染慢性化［2，3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者細(xì)胞免疫在輔助性T細(xì)胞 (Th)、DC及細(xì)胞因子等多方面均存在異常，與乙型肝炎慢性化有密切關(guān)系。

國(guó)內(nèi)外的大量研究表明，CHB患者外周血DC數(shù)量減少、表型不成熟、功能下調(diào)，我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CHB患者DC存在表型表達(dá)率下降的情況。DC分子表面標(biāo)志的表達(dá)率可作為DC的抗原提呈能力的參考指標(biāo)之一，要全面評(píng)價(jià)DC的功能是否得到恢復(fù)或者上調(diào)，單憑其表面標(biāo)志的表達(dá)水平無法作出準(zhǔn)確判斷，而混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)是DC刺激增殖功能評(píng)價(jià)的一個(gè)常用技術(shù)。因此，我們還選用了自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，目的是為了評(píng)價(jià)同一患者治療前后或抗原負(fù)載的DC，對(duì)自體淋巴細(xì)胞的增殖是否具有增強(qiáng)作用。我們的研究表明，CHB患者經(jīng)補(bǔ)腎清毒法和核苷類似物治療24周后，HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)率均較治療前升高 (P＜0.05)，但仍普遍低于健康人。DC表型的經(jīng)典分子表面標(biāo)志中的CD80和CD86是協(xié)同共刺激分子，為T/B細(xì)胞的活化提供重要的第二信號(hào)，在治療24周后，補(bǔ)腎消毒法組 HLA-DR、CD80、CD86表達(dá)高于核苷酸類似物組 (P＜0.05)。同時(shí)，CHB患者經(jīng)兩種方法治療后DC的刺激增殖指數(shù) (SI)均有所升高，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，但仍低于健康人的刺激指數(shù) (P＜0.05)。由此，我們認(rèn)為長(zhǎng)期運(yùn)用補(bǔ)腎清毒法較核苷類似物能更好的改善DC的表型，促進(jìn)其提高抗原遞呈能力［9］。

IL-12是DC細(xì)胞釋放的最有效的CTL和自然殺傷細(xì)胞活性刺激因子，在機(jī)體抗病毒和抗腫瘤等一系列免疫病理?xiàng)l件下均能發(fā)揮關(guān)鍵作用。而IL-I0是一種抑制性細(xì)胞因子，它可以通過抑制DC分化成熟及抑制IL-12的分泌來降低DC的抗原提呈功能［10］。我們發(fā)現(xiàn)治療前CHB患者IL-12水平較健康人低，而IL-10未見明顯差異，結(jié)合DC的表型表達(dá)率特別是DC成熟的重要標(biāo)志CD83的表達(dá)率和AMLR刺激指數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明CHB患者DC的成熟、抗原遞呈能力和刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力下降。經(jīng)補(bǔ)腎清毒法治療的CHB患者，IL-12水平上升趨勢(shì)在治療后期比較明顯，提示補(bǔ)腎清毒法改善DC功能是一個(gè)長(zhǎng)期的作用。同時(shí)，治療前后CHB患者IL-10水平無明顯改變，與IL-12變化未見明顯相關(guān)性，提示外周血DC分泌IL-12下降及治療后改善可能存在其他機(jī)制。有研究表明［11］，Treg可在體外誘導(dǎo)DC共刺激分子CD80和CD86的下調(diào)，且幅度非常明顯，原因是Treg抑制了DC對(duì)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的誘導(dǎo)。另一研究發(fā)現(xiàn)［12］，Treg在HBV攜帶者外周血和肝臟活檢標(biāo)本中的水平明顯高于HBV感染后自愈和健康人中的水平。認(rèn)為Treg水平的增高可能與HBeAg的水平和HBV病毒載量有關(guān)。對(duì)于補(bǔ)腎清毒法是否能夠影響Treg的功能及其水平，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示:補(bǔ)腎清毒法能改善DC的表型表達(dá)率和抗原遞呈能力及其分泌功能，為補(bǔ)腎清毒法用于CHB的治療和恢復(fù)CHB患者免疫功能提供了重要理論依據(jù)。同時(shí)也反證了CHB的中醫(yī)發(fā)病機(jī)理是HBV在人體腎氣不足，抗邪能力低下時(shí)侵襲人體，由于正氣虛羸，不足以鼓蕩邪氣向外，而毒邪伏藏體內(nèi)，邪郁日久則在風(fēng)木之春季引動(dòng)或勞累、衛(wèi)外失司時(shí)邪氣從里而發(fā)。此乃以藥測(cè)證，以證求機(jī) (病機(jī))。

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